目基因克隆和基因文库构建.pptVIP

E 基因文库的构建 基因文库的基本概念 基因文库的构建程序 基因组文库重组克隆的排序 基因文库的基本概念 基因库与基因文库 基因库（gene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库（gene library or gene bank） 基因组文库（含有全部基因） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） * 第五章 目的基因的克隆与基因文库构建 A B C D E 鸟枪法 cDNA法 PCR法 化学合成法 基因文库的构建 基因工程或 DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和 生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回 细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类： 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全 基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑 出含有目的基因的重组克隆； 一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的 基因，然后将之克隆表达。 A 鸟枪法 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载 体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体 转化受体细胞 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达 的受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立） 鸟枪法操作的改进 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高 重组子中目的重组子的出现频率。 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此 凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进 行拼接 鸟枪法操作的改进 在连接前将 DNA片段进行分级分离 例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI 片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼 脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于 冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法 鸟枪法操作的改进 凝胶 DNA片段回收技术 鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构 B cDNA法 cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA法分离目的基因的基本程序 cDNA法法克隆目的基因的局限性 mRNA cDNA第二链的合成 自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失。 cDNA法克隆目的基因的基本战略 双链cDNA的克隆 双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组 分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 cDNA法分离目的基因的基本程序 完备分离程序 提取细胞总mRNA，合成总 cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子。 筛选时 ，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法 筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆， 如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等 cDNA法分离目的基因的基本程序 cDNA法分离目的基因的基本程序 差异分离程序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对 应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因 例如：正常的大鼠 FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能 自发表达的，需在多瘤病毒感染之