利用重组腺病毒载体进行肿瘤基因治疗的研究-肿瘤学专业论文.docx

摘 摘 要 肿瘤是严重威胁人类健康的恶性疾病。目前对肿瘤的治疗仍以传统的 手术切除和化疗、放疗为主。但这些治疗方法对人体的损伤很大，而且不 能解决肿瘤的复发问题，难以根治肿瘤。基因治疗的出现为肿瘤治疗带来 了新希望。基因治疗是通过外源性遗传物质(目的基因)导入机体靶细胞 而治疗疾病的方法，能否成功很大程度上取决于能否建立一套安全、有效、 简便的基因转移方法。腺病毒载体是目前应用得最广泛的向人体细胞转移 遗传物质的载体之一。 上海三维生物技术有限公司一直致力于研究和开发用于肿瘤基因治 疗的基因重组腺病毒系列产品。H101是上海三维生物技术有限公司构建 第一个的具有自主知识产权的基因治疗产品，目前已通过临床II期研究。 H101在正常细胞中不能复制，在HT一29、A549等肿瘤细胞系中能选择 性地复制，产生溶瘤作用。为了观察加热条件下H101对肿瘤细胞杀伤作 用的稳定性，我们对H10l进行了热稳定性检测，结果表明：热休克处理 不会影响H10l对肿瘤细胞的杀伤活性；细胞在不同时间点接收热休克处 理后，Hsp70的表达量均明显上升。所以我们可以选择H10l病毒复制的 高峰期进行热诱导。这样可以进一步增强病毒的复制能力，达到更好的溶 瘤效果。 为了实现对肝癌细胞的靶向性基因治疗，上海三维生物技术有限公司 构建了产权自主的基因重组腺病毒H102，插入AFP启动子(Ⅱ一fetoprotein Promotor)作为特异性启动子，使该系列腺病毒只能在AFP阳性的肝癌细 胞中选择性复制，产生溶瘤作用并表达携带的治疗基因。在正常组织和细 胞中则不能复制和表达治疗基因，从而达到靶向性基因治疗的作用。 H102 M1型腺病毒是为了检测H102系列的细胞特异性而构建的，它 删除了V型腺病毒的E1B区和E3区，插入AFP启动子和作为报告基因的 碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)。细胞特异性实验表明，H102 Ml 携带的报告基因能在AFP阳性的HepG2和Hep3B细胞中表达，而且表达 量随病毒感染的MOI增高而增加。而在AFP阴性的细胞如HcT—116和 HT一29中，不存在来源于H102 M1型腺病毒的AP蛋白表达。细胞特异 性实验的结果证实通过插入的AFP启动子能够实现转移基因在AFP阳性 细胞中的选择性表达。如果我们把报告基因换成治疗基因，就可以实现治 疗基因在肝癌组织中的靶向性表达，在达到选择性杀伤肝癌细胞的同时， 对正常细胞不产生影响。而且，因为在一般情况下，只有肝癌组织的细胞 对正常细胞不产生影响。而且，因为在一般情况下，只有肝癌组织的细胞 能够产生AFP，一旦肝癌完全治愈后，即使还有腺病毒存在，治疗基因也 不能表达，这样同时解决了治疗基因的表达调控问题。 H102D是上海三维生物技术有限公司构建的重组溶瘤性腺病毒，它删 除了人v型腺病毒的E1B区和E3区，插入AFP启动子为特异性启动子， 同时插入TRAIL(王NF—Related Apoptosis Inducing Ligand)基因。在AFP 启动子的调控下，H102D通过以下两方面机理来治疗肝癌：(1)在AFP 阳性的肝癌细胞中选择性复制，产生溶瘤作用，杀死肝癌细胞；(2)在 AFP阳性的肝癌细胞中表达TRAIL基因，诱导肝癌细胞发生凋亡。 细胞感染H102D后的生长曲线检测结果显示，高MOI感染时，H102D 能显著抑制AFP阳性肝癌细胞的生长。以同样的MOI感染AFP阴性的 WI一38细胞和张氏肝细胞，细胞生长基本不受影响。说明AFP能有效地 调控基因治疗腺病毒的复制和治疗基因的表达，使H102D只在AFP阳性 的肝癌细胞中选择性复制并表达TRAIL基因诱导肝癌细胞凋亡。 H103是上海三维生物技术有限公司在H10l的基础上开发的具有自 主知识产权的基因治疗用重组腺病毒产品，删除了腺病毒的E1B区和E3 区，插入CMV启动子和重组热休克蛋白70(Hsp70)基因，可在肿瘤组 织中复制，杀死肿瘤细胞，并且能激活机体免疫，对远端的转移肿瘤也有 较好的疗效。 通过实验摸索，我们建立了对H103中的插入基因CMv—HSP的PCR 检测方案。经鉴定，H103病毒DNA中含有正确大小的插入基因片段。 为了在今后的前期实验和临床试验中从组织样品中检测出低浓度的 H103DNA，我们另外设计了一对针对CMV和部分HSP的引物：A43一l 和HLW一1，它的产物大小只有1kb左右。利用这对引物，我们对CMV ～HSP插入基因进行了梯度PCR检测。结果显示：采用Taq酶系统，检测 灵敏度可以达到1040PU／I．tl，采用Taq plus酶系统，检测灵敏度可以提高 到1030PU／gl，完全可以满足质检和临床试验检测的要求。 对H103中Hsp70插入基因表达量的检测