磷酸钙盐沉淀法建立质粒双转染细胞模型.DOC

PAGE PAGE 1 磷酸钙盐沉淀法成功建立稳定的双质粒转染细胞模型 马桢1,2，黄雄2,牛玉宏作者单位1：上海复旦大学附属中山医院心血管病研究所，200032；2：上海复旦大学附属中山医院青浦分院综合ICU，201700.通讯作者：邹云增，Email： zou.yunzeng@zs-hospital.sh.cn基金编号：国家973项目（2007CB512003），国家自然基金重点项目（30 作者单位1：上海复旦大学附属中山医院心血管病研究所，200032；2：上海复旦大学附属中山医院青浦分院综合ICU，201700. 通讯作者：邹云增，Email： zou.yunzeng@zs-hospital.sh.cn 基金编号：国家973项目（2007CB512003），国家自然基金重点项目C140401） 【摘要】目的：建立表达血管紧张素II受体1型（AT1）和钙/钙调蛋白依赖性激酶II（CaMKII）或DN（CaMKII的活性抑制体）的双质粒转染COS7细胞模型，观察其ERK反应。方法：通过扩增、筛选及抽提得到相关质粒，双酶切法及琼脂糖电泳鉴定目的DNA片段。磷酸盐钙沉淀法将质粒AT1和CaMKII/WT或CaMKII/DN转入COS7细胞内。以免疫荧光法（IF）、免疫印迹法（WB）测定细胞表面表达的AT1(及其所带的HA-tag)、胞浆内表达的CaMKII/WT或CaMKII/DN(及其所带的V5-tag)。给予转染细胞以血管紧张素II（AngII）、AT1受体拮抗剂（ARB）+AngII等刺激，WB测定p-ERK改变。结果：质粒酶切后电泳可见目的长度DNA片段。在转染细胞中，IF呈阳性荧光反应，WB可发现目的蛋白；而未转染细胞中则否。AngII刺激引起转染AT1和CaMKII/WT的细胞产生p-ERK升高反应，可为ARB预处理消除；而未转染细胞及转染AT1和CaMKII/DN的细胞无类似反应。结论：磷酸钙盐沉淀法可成功建立该双转染细胞模型。 【关键词】磷酸钙盐沉淀法；双转染；质粒；AT1；CaMKII 【中图分类号】R331 【文献标识码】A Stable transfection of two expression plasmids in cells by calcium phosphate precipitation procedure MA Zhen1,2,HUANG Xiong2,NIU Yu-hong1 ,GONG Hui1,ZOU Yun-zeng1,△，1: Shanghai Institute of CardiovascuLar Diseases,Zhongshan Hospital,Fudan University , Shanghai，200032 China;2: Department of Intensive Care Unit,Qingpu branch of Zhongshan Hospital,Fudan university, Shanghai,201700 China [Abstract]Objective: We use calcium phosphate precipitation procedure to stable transfect two expression plasmids (angiotensin II receptor type 1(AT1)and Ca2+/camoduLin-dependent kinase II(CaMKII) or DN(a domain negative mutant of CaMKII))in COS7 cell and observe the phosphorylation of ERK . Methods: The palsmids we used were obtained by amplification、selection and extraction. The DNA fragments were verified by double enzyme digestion and agarose gel electrophoresis. AT1 and CaMKII/WT or CaMKII/DN expression plasmids were transfected into cells using calcium phosphate precipitation method. Immunofluorence(IF)and Western blotting (WB) methods were used to measure the expression of AT1 (and i