第11章生物芯片运用应用技术.ppt

第十一章 生物芯片技术 第十一章 生物芯片技术 第一节 生物芯片的制备 第二节 样品与探针制备 第三节 杂交反应及过程控制技术 第四节 杂交图谱的信号检测技术 第五节 数据分析 第六节 生物芯片的种类 第七节 生物芯片的应用 常见的芯片可分为两大类：一类是原位合成；另一类是直接点样。 原位合成适用于寡核苷酸； 直接点样多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。 直接点样法比原位合成法简单，只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻璃片或其它材料上即可。 原位合成有两种途径。一是光蚀刻法；一是喷印法。 光蚀刻法可以合成30nt左右，喷印法可以合成40-50nt； 光蚀刻法每步缩合率较低，一般为95%左右，合成30nt产率仅20%； 喷印法可达99%以上，合成30nt产率可达74%，从这个意义上说喷印法特异性应比光刻法高。此外，喷印法不需特殊的合成试剂。 第一节 生物芯片的制备 1.1 原位光蚀刻合成 1.2 原位喷印合成 1.3 点样法 1.4 微电子芯片 1.5 三维芯片 1.6 流过式芯片（flow-thru chip） 1.1 原位光蚀刻合成 Affymetrix公司率先开发的寡聚核苷酸原位光刻专利技术，是生产高密度寡核苷酸基因芯片的核心关键技术。 原理如下页图所示 每次通过控制蔽光膜的图案(透光与不透光)决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。 使用多种蔽光膜能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。 某一含N个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×N个化学步骤能合成出4N个可能结构。例如：一段8个碱基的寡核苷酸有65，536种排列的可能，通过32个化学步骤，8个小时就能合成65，536个探针。 优点： 用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。 合成的探针阵列密度可高达到106/cm2。 缺点： 每步合成反应产率比较低，不到95%。探针的长度受到了限制。 Affymetrix将光引导合成技术与半异体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，使每步产率增加到98%。 该方法同时解决了由于蔽光膜透光孔间距离缩小而引起的光衍射问题，有效地提高了聚合点阵的密度。 利用波长更短的物质波如电子射线去脱保护可使点阵密度达到1010/cm2 1.2 原位喷印合成 芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。 喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。 化学原理与传统的DNA固相合成一致，不需要特殊制备的化学试剂。 1.3 点样法 点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。 一些研究者采用人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学处理后的载玻片上，经一定的化学方法处理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于载玻片上，制备好的DNA芯片可置于缓冲液中保存。由于方法费时费力，不适于大规模DNA芯片制作。 有的研究者用多聚赖氨酸包被固相支持物（玻片），经过分区后用计算机控制的微阵列点样机按照预先设计顺序点上核酸分子，点样量很小，约为5nl。大规模cDNA芯片多采用这种方法。 与其寡核苷酸微芯片相比：DNA芯片的潜在优越性是具有更强的亲和性和特异性杂交，但是需要大量制备，纯化，量化，分类PCR产物。 有的研究者将玻片上覆盖20μm厚薄层聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用机械刻写或光刻的方法在其表面划上网格。 然后用激光照射蒸发掉单元间隙的多余凝胶，以实现DNA芯片分区，单元大小为 40×40μm或 100×100μm，间隔分别为50μm和100μm。 将化学方法合成的寡核苷酸探针自动化点样于各个单元内而制成DNA芯片，点样速度可达2000单元/秒。 点样装置采用的机器人有一套计算机控制三维移动装置、多个打印/喷印针的打印/喷印头；一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。 根据需要还可以有温度和湿度控制装置、针洗涤装置。 打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。直接打印时针头与芯片接触，而在喷印时针头与芯片保持一定距离。 打印法的优点是探针密度高，通常1平方厘米可打印2,500个探针。缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。 喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长。缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常1平方厘米只有400点。 1.4 微电子芯片 微电子芯片是由美国Nanogen公司开发的，目前国内清华大学和复旦大学也在开发这一技术。 微电子芯片是多位点电控阵列、并含独立可寻址检测区域的微