植物组织培养-外植体选择与建立.pptVIP

第三节 外植体（培养物）的建立 1、主要任务：成功的将外植体建立在试管中。 2、主要技术环节： （1）、外植体的选择 （2）、外植体的消毒 （3）、培养基的选择、配制 （4）、外植体消毒与接种 3、关键问题： （1）、污染（Infection） （2）、褐变（Browning） 第二节 外植体（培养物）的选择 根据细胞全能性学说，植物体的每一个细胞都含有全部的遗传信息，都能再生出一个新植株。但是，要使每个细胞的全能性都表现出来，在目前还是不易做到的事。因而，外植体（初始培养物）的选择非常重要。 第二节 外植体（培养物）的选择 1、基因型： 再生能力 （1）、双子叶单子叶； （2）、被子植物裸子植物； （3）、双子叶植物中：茄科（Solanacea）；秋海棠科（Begoniaceae）；景天科（Crassulaceae）；苦苣苔科（Gesneriaceae）；十字花科（Cruciferae）再生力特强；郁金香（Tulip）再生力较弱。 （4）、同一种植物中：活体（in vivo）再生力强者，离体（in vitro）再生力也强。 第二节 外植体（培养物）的选择 第二节 外植体（培养物）的选择 2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择： 第二节 外植体（培养物）的选择 2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择： 第二节 外植体（培养物）的选择 2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择： 第二节 外植体（培养物）的选择 第二节 外植体（培养物）的选择 第二节 外植体（培养物）的选择 3、根据时间和季节取材 第二节 外植体（培养物）的选择 3、根据时间和季节取材 第二节 外植体（培养物）的选择 4、根据母株位置选择： 第二节 外植体（培养物）的选择 第二节 外植体（培养物）的选择 第二节 外植体（培养物）的选择 第二节 外植体（培养物）的选择 第二节 外植体（培养物）的选择 4、根据外植体的大小选择： 第二节 外植体（培养物）的选择 第三节 外植体（培养物）的建立 4、污染（Infection） 能否有效地控制微生物污染是植物离体培养是否成功的关键技术之一。对于离体培养的探索性研究实验，污染会导致实验失败；对于大规模的离体繁殖生产来说，污染使生产成本大大增加。因此，无论是科研机构还是生产厂家都十分重视微生物污染问题。 植物离体培养中的污染可分为外植体、培养基、无菌操作和培养环境四个方面。其中培养基和无菌操作方面的污染，目前已得到十分有效的控制。外植体方面污染最复杂，也最难控制，其可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的；微生物可能是附生性的，也可能是内生性的。近年来，国外较重视各种微生物的鉴定，并根据不同的微生物种类采取相应的控制措施，这方面的研究进展较快。 第三节 外植体（培养物）的建立 （1）、产生污染的因素： ①外植体：通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多；老的材料比幼嫩的带菌多；田间生长的材料比温室的带菌多；带泥土的材料比清洁的带菌多。一年中以雨季的材料带菌多，一天中以中午阳光最强时的材料带菌少。 ②培养基：高压蒸汽灭菌的温度、压力、时间和正确使用情况，以及过滤灭菌中过滤膜孔径、过滤灭菌器械的灭菌处理、过滤灭菌操作等均影响培养基的灭菌效果。 ③操作环节：接种室是否清洁、干燥、密闭，是否经常用紫外线灯照射、甲醛熏蒸、70％酒精喷雾杀菌等，操作是否等熟练。 ④培养环境：培养室要求清洁、密闭。每天用70％酒精喷雾除菌、降尘，每周用少量甲醛熏蒸灭菌。如有空气过滤装置效果更好。培养室相对湿度太高时，污染加重。 第三节 外植体（培养物）的建立 （2）、污染的防止： 母株保护：保持母株清洁，减少喷灌。温室种植，喷施杀菌（虫）剂，减少病原菌含量。 材料选择：选取生长发育健壮，病虫危害少的材料。 严格清洗、消毒与无菌操作。 小容器、分散接种。 第三节 外植体（培养物）的建立 （3）、污染估算及对策： 污染估算：首次接种通常污染率40—60% 按40%计：接种100个材料 1个材料/容器： 污染量=100X40%=40 获得量=100-40=60。 2个材料/容器： 2污染：1X40%X40%=16% 1污染：2X40%X40%=32% 2未污染：60%X60%=36% 污染率=100-36=62% 污染量=100X62%=62 获得量=100-62=48 3 个材料/容器： 污染率=100-（60%）3=78.4% 污染量=100X78.4%=79 获得量= 100X（60%）3= 21 4 个材料/容器： 获得量= 100X（60%）4=13 5 个材料/容器： 获得量= 100X（60%）5=8 防止污染的对策： 小容器、多数量、尽量分散、相互隔离 第三节 外植体（培养物）的建立 （4）、附生菌控制：