目的基因的克隆.pptVIP

一 鸟枪法 二、 cDNA法 三 PCR法 四 化学合成法 第三节 目的基因的克隆 三 PCR法 二 cDNA法 一 鸟枪法 四 化学合成法 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。 1.鸟枪法克隆目的基因的基本战略 2.鸟枪法操作的改进 3.鸟枪法克隆目的基因的局限性 基因测序“鸟枪法”，也俗称“霰弹法”。简单地说，它有点类似生活中玩的拼图游戏。拼图游戏是将一个完整的画面分成杂乱无章的碎块，然后重新拼装复原。而“鸟枪法”则是先将整个基因组打乱，切成随机碎片，然后测定每个小片段序列，最终利用计算机对这些切片进行排序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置。 “鸟枪法”最初主要用于测定微生物基因组序列。近年来，美国塞莱拉公司先后利用改进的全基因组“鸟枪法”完成了果蝇和人类基因组的测序工作，证明了它在测定大基因组上的可行性和有效性。“鸟枪法”优点是速度快，简单易行，成本较低。 1.鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。 （1）染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控。 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。 （2）与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载 体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体。 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为 （3）转化受体细胞 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达 的受体细胞。 （4）筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）。 2.鸟枪法操作的改进 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率。 （1）使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 例如，已知某目的基因位于1.8 kb的Sal I片段中，将染色体DNA用Sal I切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接 在连接前将DNA片段进行分级分离 2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb 冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法 凝胶DNA片段回收技术 结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质粒DNA的目的。适合于从1～4 mL细菌培养物中提取多至20μg 高纯的质粒DNA，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。 3.鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构 1.cDNA法克隆目的基因的基本战略 2.cDNA法分离目的基因的基本程序 3.cDNA法法克隆目的基因的局限性 mDNA （1）cDNA第一链的合成 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ cDNA第一链 引物 退火 逆转录酶 dNTPs 1.cDNA法克隆目的基因的基本战略 （2）cDNA第二链的合成 煮沸 NaOH ①自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失 AAAAAAAAAAAAAA 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAA