狼疮性肾炎肾阴虚证DNA消减文库的构建-中西医结合内科学专业论文.docxVIP

硕士学位论文 硕士学位论文 狼疮性肾炎肾阴虚证DNA消减文库的构建 硕士研究生：付婷婷 指导教师：罗仁 摘要 目的：建立抑制性消减杂交方法以筛选人白细胞中的差异基因，并检验其 筛选效能。构建狼疮性肾炎肾阴虚证DNA消减文库。 方法：首先参照Akopyants等方法建立抑制性消减杂交法以筛选人血白细 胞中人基因组的差异基因，并检验其筛选效能：选健康的汉族人抽取静脉血(抗 凝)2ml，提取白细胞基因组DNA。将DNA分为两份，其中一份加入lOng质粒 pUCm—T作为实验方(Tester)，此经Rsa I酶切的质粒pUCm—T DNA片段作为所 要筛选的差异基因。然后从狼疮性肾炎肾阴虚证入手，按美国风湿病协会1982 年系统性红斑狼疮诊断标准，选取汉族人确诊为系统性红斑狼疮患者，狼疮患 者有下列任一项肾受累表现者即可诊断为狼疮肾炎：1、蛋白尿0．59／24hr； 2、血尿RB C5个HPF离心尿3、肾功能下降；4、肾小管功能异常；5、肾活 检异常。确诊为狼疮性肾炎患者，依据肾虚证诊断标准，辨证为肾阴虚证患者， 应用现代分子生物学技术一抑制性消减杂交(suppression subtractire hybridization，SSH)、聚合酶链式反应(polyaerase chain reaction，PCR)、 基因克隆(gene clone)等方法构建狼疮性肾炎肾阴虚证的正、反向DNA消减 文库，再运用斑点杂交原理(dot blot)去除假阳性克隆，从而构建狼疮性肾 炎肾虚证DNA消减文库。随机抽取阳性克隆进行测序，测序后使用以下基因库 http：／／wWW．ncbi．nlm．nih．gov／blast／进行序列的同源性分析以验证该文库 是否含有基因片段。 结果：本实验成功将经Rsa I酶切的质粒pUCm—T DNA片段筛选出来，说 明建立的筛选复杂基因组中差异基因的SSH方法是成功的，可用于构建狼疮性 肾炎肾阴虚证DNA消减文库。首次成功地构建了汉族人LN肾阴虚证的DNA 中文摘要消减文库，经篮白斑筛选后，正向消减文库得到295个克隆，反向消减文库得 中文摘要 消减文库，经篮白斑筛选后，正向消减文库得到295个克隆，反向消减文库得 到286个克隆。经过点杂交(dot blot)进一步筛选阳性克隆，分别从正向文库 和反向文库中各抽取5个阳性克隆，进行测序及同源性分析，结果发现正向文 库中有1个克隆测序不成功，1个克隆为DNA重复序列，其他3个克隆涉及到 免疫(白介索18受体、白介素10)以及未知功能的基因。反向文库有1个克隆 测序不成功，1个克隆为DNA重复序列，1个克隆未见有同源基因，其他2个 克隆分别为p40以及未知功能的基因等。 结论：我们成功建立了能够筛选出两个DNA消减文库中的差异DNA片段 的方法，该法具有效率高、易筛选、易操作、灵敏性高、特异性高等优点，有 利于对低拷贝差异基因的克隆。虽然有对起始材料要求较多，对完全无酶切位 点的基因组无法筛选等不足，仍为筛选差异基因较好的方法，十分适用于克隆 分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能，为进一步克隆肾阴虚证的相关基 因提供了新的手段。成功地构建了LN肾阴虚证的DNA文库，经同源性分析， 初步证实该库含有基因片段，由于这些DNA片段仅为基因的部分片段，所以尚 不能确定这些基因是否为LN肾阴虚证的相关基因。本实验为进一步克隆肾阴虚 证相关基因奠定基础，下一步应利用本实验方法构建多个病种肾阴虚证的DNA 文库，从而筛选出肾阴虚证共同的相关基因，并研究这些基因在肾阴虚证中的 作用，以明确其是否为肾阴虚证的相关基因。 关键词：狼疮性肾炎肾阴虚证抑制性消减杂交基因克隆 II 硕士学位论文To 硕士学位论文 To construct DNA subtractive library of kidney yin deficiency syndrome of lupus nephropathy Name：Futingting Supervisor：LuoRen ABSTRACT OBJECTIVE：To build uD the method of SSH and test itS power．To construct DNA subtractive library of kidney Yin deficiency of lupus nephropathy． METHODS：suppression subtractive hybridization(SSH、was used to obtain differentially genes associated with kidney yin deficiency syndrome of LN， co