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第一章 蛋白质的分离与纯化 第一章 蛋白质的分离与纯化 第一章 蛋白质的分离与纯化 色谱流出曲线 色谱流出曲线和色谱峰 基线（a） 峰高（h） 保留值 死时间t0 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。 3. 调整保留时间tr′ 某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即 tr′= tr ? t0 由于组分在色谱柱中的保留时间tr包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tr实际上是组分在固定相中保留的总时间。 保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。 4. 死体积V0 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco（cm3·min-1）计算。 V0 = t0Fco 式中 Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。 仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。 5. 保留体积Vr 指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系： Vr= tr Fco 6. 调整保留体积Vr? 某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。 Vr? = Vr ? V0 = tr? Fco 7. 相对保留值r2,1 某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。 r2,1= tr2 ? / tr1′= Vr2? / Vr1? 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号?表示，即 ? = tr ?(i) / tr ? (s) 式中tr ?(i)为后出峰的调整保留时间，所以?总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。 区域宽度 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。 1. 标准偏差? 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。 2. 半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为 W1/2=2.354? 3. 峰底宽度W 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差?的关系是 W = 4 ? 从色谱流出曲线中，可得许多重要信息： (i) 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数； (ii) 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析； (iii) 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析； (iv) 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据； (v) 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。 葡聚糖凝胶(G) §9 蛋白质的研究历史与方法 SDS－PAGE电泳是应用聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质分子量的一种有效的方法。SDS是阴离子变性剂，使蛋白质分子变性为直链状，且其所带阴离子将蛋白质分子所带电荷完全履盖，具有相似的荷质比，电泳过程完全与蛋白质的分子量相关。电泳结束后的凝胶用考马斯亮兰或银染后与已知分子量的蛋白质的标准蛋白比较得出。 §9 蛋白质的研究历史与方法 二维电泳是等电聚焦电泳与SDS－PAGE电泳结合的双向电泳。电泳过程用柱状等电聚焦电泳后再行SDS－PAGE电泳，等电聚焦电泳利用蛋白质等电点进行分离，SDS－PAGE根据蛋白质分子量实现分离。因为等电点相同而分子量也相同的蛋白质几乎是不存在的，所以二维电泳可将所有蛋白质分子分开。 等电点聚焦（isoelectric focusing） 毛细管电泳