山药提取物对人冠状动脉与主动脉内皮细胞TIPE2与PCNP基因表达的影响-临床医学、内科学专业论文.docxVIP

The Effect of Dioscorease Rhizome Extract on the Gene Expression of TIPE2 and PCNP in Human Endothelial Cells from Coronary and Aorta A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Medicine By Cheng-Yun Yan Supervisor : Prof. Qi-Lin Wan Prof. Guan-Chang Cheng May, 2015 I I PAGE PAGE II 摘 要 背景 动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是一类主要累及大、中动脉的动脉硬化性疾病， 表现为动脉的内膜层的脂质沉积、脂纹形成、粥样斑块、斑块破裂出血、血栓形成等一 系列病理变化，最终导致血管管腔慢性狭窄甚至血栓形成发生急性闭塞，危及生命。随 着其发病率的逐年增加，科学家对 AS 的研究也越来越深入、越来越广泛，发病机制众 说纷纭，但目前得到广泛认同的主要有两种学说：炎症学说和内皮损伤学说，认为炎症 因子和免疫反应在 AS 发病的整个过程中均起到至关重要的作用。 山药营养丰富，价格低廉，既能作为食物供人们食用，又能作为药物用于疾病的治 疗，自古以来都受到人们的喜爱。以山药提取物（Dioscorease rhizome extract, DRE）为 主要成分的药物制品也已在临床应用多年，主要用于高血脂、冠心病等动脉粥样硬化性 疾病的预防与治疗。但在临床上缺乏大型的临床试验为其提供循证医学证据，在分子机 制方面的研究更是少有，因此山药抗动脉粥样硬化的机制尚不明确。 PCNP（PEST-containing nuclear protein）是一类新近发现的核蛋白，也是一种亲水 性的蛋白，其结构中富含 PEST 序列，是 NIRF 的底物，容易被 NIRF 介导泛素化，从 而被蛋白酶降解，因此其半衰期较短，相对较不稳定。研究发现，PCNP 参与细胞周期 的调控过程及肿瘤细胞的发生与发展进程，在类风湿性关节炎的发生与发展中可能也起 到一定的调节作用。TIPE2（tumor necrosis factor-α-induced protein 8-like 2）是新近发现 的对细胞凋亡起调节作用的蛋白，研究发现其对先天性免疫及获得性免疫具有负性调节 作用，并参与维持机体的免疫内稳态。由于在抗菌免疫机制中亦产生负性调节作用，过 表达可能会促进细菌感染后炎症反应的发生，造成严重的全身炎症反应。同时还发现 TIPE2 参与多种肿瘤细胞的发生与发展进程。近期的研究发现巨噬细胞中的 TIPE2 通过 对免疫反应起到负性调节作用，从而对动脉粥样硬化进程具有一定的抑制作用。 本实验 预从 DRE 入 手 ， 探 讨 在 人 冠 状 动 脉 内 皮 细 胞 （ human coronary artery endothelial cell, HCAEC）及主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cell, HAEC）中 PCNP 与 TIPE2 的表达量是否随着 DRE 浓度的变化而变化，以及两种细胞内的蛋白表 达是否有差异，为进一步研究 DRE 与 AS 的关系及新药的开发提供理论依据。 目的 通过检测 HCAEC 及 HAEC 内 PCNP 与 TIPE2 的表达量随 DRE 浓度的变化情况， 探讨 DRE 与 AS 的关系。 方法 将 DRE 用 DMEM 细胞培养液完全溶解制得 10mg/ml 的 DRE 原液，再将 DRE 原液 稀释为如下三种浓度：1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml，分别培养 HCAEC 及 HAEC 24h、 48 h、72 h，并设置对照组（0μg/ml）。通过 MTT 法绘制细胞生长曲线，检测不同浓度 DRE 对两种细胞生长的影响；提取细胞内的 RNA，反转录为 cDNA，通过实时定量 PCR （Real time-PCR，RT-PCR）法检测不同浓度 DRE 培养两种细胞，经过不同时间后细胞 内 PCNP 和 TIPE2 基因表达的变化；通过免疫印迹法（Western Blotting）检测经过 DRE 培养后 HCAEC 和 HAEC 细胞内 PCNP 和 TIPE2 蛋白的表达量的变化。 结果 MTT 结果显示：不同浓度的 DRE 对 HCAEC 和 HAEC 细胞的生长未产生明显影响 （P＞0.05）；R