山核桃COP1等成花相关基因的克隆及其表达特性分析-森林培育专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 独 创 性 声 明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，并且是自 己撰写的。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得在浙江农林大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定.与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明 确的说明，并表示了谢意。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位论文作者亲笔签名： 日 期： 论文使用授权的说明 本人完全了解浙江农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交 学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅 览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。□ 不保密，本学位论文属于不保密。 □ （请在方框内大“√”） 学位论文作者亲笔签名： 日 期： 指导老师亲笔签名： 日 期： 摘要 摘要 摘要 成花是植物生活史上一个质变的过程，即从营养生长向生殖生长、孢子体向配子 体转变的重要转折点，是植物发育过程中的关键环节，整个过程有着复杂的分子调控 网络。近几十年来，利用分子生物学等技术研究花的发育，尤其是成花基因的克隆， 极大地促进了成花机理的研究。山核桃（Carya cathayensis Sarg.）隶属胡桃科山核桃 属（Carya Nutt.），是浙江省的特色经济干果。山核桃雌雄同株，雄花为下垂的葇荑 花序，雌花为短穗状花序，它们的形成存在着时空上的差异。山核桃成花对山核桃的 产量至关重要。因此，研究山核桃的成花，阐明其调控机制，对提高山核桃产量是十 分必要的。之前我们已经掌握了山核桃雌雄花芽的分化发育的各个时期，但是成花的 分子机理仍然需要进一步的深入研究。本课题组利用454测序技术对山核桃成花过程 进行了深度测序，其中测得CcCOP1 E3连接酶，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，泛素活化 酶E1，泛素蛋白连接酶RIN2-like和SPINDLY-like基因的片段，利用RACE技术克隆获 得了这5个基因的全长；利用生物信息学手段分析了它的蛋白特性和不同物种的同源 基因之间的亲缘关系；利用Real-Time PCR技术进一步分析了在这五个基因雌雄花发 育过程中的表达变化。这为以后更好地掌握其他基因的调控机理打下了坚实的基础。 主要研究结论如下： （1）从山核桃花芽中得到 CcCOP1 E3 连接酶基因大小为 2331bp，编码 707 个氨 基酸，由 2 个特殊的结构域组成即环形锌指结合域和 WD-40 重复序列，其编码的蛋 白亲水性较强，亲水性氨基酸主要集中在氨基端，疏水性氨基酸主要集中于羧基端； 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶基因大小为 1895bp，编码 626 个氨基酸，它由 2 个特殊的 结构域 TPR 结合域和 MPP 组成；泛素活化酶 E1 基因大小为 3346bp，编码 1112 个氨 基酸，由 2 个重复的结构域组成即 E1-enzyme 超级家族组成；泛素蛋白连接酶 RIN2-like 基因大小为 1761bp，编码 587 个氨基酸，由特殊的结构域 RING 型结构域组成； SPINDLY-like 基因大小为 2274bp，编码 754 个氨基酸，由 4 个重复的 TPR 超级家族 结构域组成。 （2）将这五个基因分别与已知的其他物种的同源序列进行 Blast 比对后构建系 统进化树。分析表明：CcCOP1 E3 连接酶与蓖麻等的亲缘关系最近，与乌拉尔图小麦 和二穗短柄草等的亲缘关系相对较远；丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶与葡萄等的丝氨酸/ 苏氨酸蛋白磷酸酶亲缘关系最近，与玉米等的亲缘关系相对较远；泛素活化酶 E1 与 I 与甜橙等的泛素活化酶 E1 亲缘关系最近，与短花药野生稻等的亲缘关系相对较远； 泛素蛋白连接酶 RIN2-like 与野草莓等的泛素蛋白连接酶 RIN2-like 亲缘关系最近，与 灰仓鼠等的亲缘关系相对较远；SPINDLY-like 基因与罗莎等的 SPINDLY-like 基因亲缘 关系最近，与黄瓜等的亲缘关系相对较远，表明这该基因的进化过程存在种属差异性。 （3）实时定量 PCR 分析表明，CcCOP1 E3 连接酶，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶， 泛素活化酶 E1，泛素蛋白连接酶 RIN2-like 和 SPINDLY-like 基因在山核桃的茎、叶、 果实、花芽中均有表达，但在花芽中表达量最高，且它们的表达贯穿于山核桃雌雄花 的整个发育过程，3 月中旬表达量最高，在雄花 5 月中旬表达量相对较高，所以推测 CcCOP1 E3 连接酶，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，泛素活化