盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度试验报告.docVIP

盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度试验报告 现代农业科技)2007篁墨塑大田农艺 盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度试验报告 黄象男任建升郑祥艳郭晓慧李永强 (郑州大学生物工程系,河南郑仆I450001) 接要种子贮藏蛋白是种子基因表达的产物,可以反映遗传背景的差异.试验通过对玉米种子盐溶蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳,利用 其电泳谱带特征鉴定种子纯度.玉米盐溶蛋白电泳谱带可根据分子量大小划分为3个区域:区,p区,区,其中p区是判断种子纯度的 主要依据,区其次,区影响不明显.结果表明,提取时间和样品浓度都对电泳有重要的影响,过氧化氢的加入量对电泳效果影响不大.同 时.对实验中出现的其他技术问题进行探讨. 关键词玉米;盐溶蛋白;聚丙烯酰胺凝胶电泳;种子纯度 玉米是世界四大粮食作物之～,播种面积仅次于水稻 和小麦.我国的玉米面积稳定在2000万公顷左右,目前几 乎全部是杂交种.从1993年的数据看,虽然播种面积比 1992年减少了34.94万公顷,但产量却增加了732.1万吨 (刘江等1994)t”.玉米产量的提高当前主要是依靠优良杂 交种的普及.而推广优良的杂交种需要大量优质种子.我国 每年杂交玉米种植124.47万公顷左右.需用杂交种8～9亿 千克以上【卜.杂交种中每混杂1%的自交系种子就会减产 0.6%.种子纯度每提高1个百分点,可以增加产量225 kg/hm2,可见种子纯度的提高对玉米产量的增加具有重要 的意义141. 品种纯度是指某一品种群体在特征,特性方面典型一 致的程度,它是种子质量评价的重要指标.直接影响作物丰 产性,稳定性,整齐一致性和抗性15t.种子纯度检验包括真实 性鉴定和纯度检验两个方面.其实质都是鉴定种子的基因 型.目前.国内外普遍采用的鉴定方法有:形态学方法,生化 方法和分子生物学方法『4.q.盐溶蛋白电泳法鉴定玉米品种 的纯度是基于玉米品种间蛋白组成的差异.该方法具有准 确性高,分辨能力强,速度快,经济便捷,不受环境影响等优 点,因而被列为行业标准(NY/T449-2001).本试验采用国 标的方法鉴定玉米种子纯度.并分析了影响玉米盐溶蛋白 聚丙烯酰胺电泳分离效果的主要因素及电泳操作中应注意 的问题.为玉米纯度鉴定工作提供信息和依据. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1试验材料.玉米种子:益丰2号.冀农61号.泛玉2 号,科河8号. 1.1.2试剂.丙烯酰胺,N—N亚甲基双丙烯酰胺,乳酸,乳 酸钠,甘氨酸,抗坏血酸,氯化钠,蔗糖,甲基绿,三氯乙酸, 过氧化氢,考马斯亮蓝R-250,冰醋酸,无水乙醇(化学试剂 均为分析纯,水均为去离子水). 1.1.3仪器.电泳仪(500_+5V连续可调,0-400mA连续输出 功率200W),垂直板夹心式电泳槽,单粒粉碎器,天平 (0.01g,0.001g,0.000lg各1台),pH试纸,高速离心机 作者简介黄象男(1968-),女,学士学位.郑州大学生物工程系实验 师.在读研究生,研究方向为植物生理学及植物细胞工程. 收稿日期2oo7—06—01 100 (5000r/min以上),电冰箱,微波炉,离心管(1.5mL),离心 管架,微量进样器,量简,烧杯,玻璃棒. 1.2方法 1.2.1样品制备.参照国标(NY/T449-2001)作适当改进: 从各样品中随机取种子.用单粒粉碎器粉碎.加入1.5mL离 心管中.用滴管加入与样品体积相同的样品提取液.摇匀, 放置5min后,再摇1次,30min后,用离心机5O00r/min离 心15min,取上清液用于电泳. 1.2.2凝胶制备.按照《玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方 法》(NY/T449-2001)规定制备.分离胶:丙烯酰胺11.25%, 双丙烯酰胺0.375%;浓缩胶:丙烯酰胺6%,双丙烯酰胺1%. 1.2.3电泳.在500V电压下稳压电泳,待甲基绿指示剂移 至胶底部边缘时,关闭电源. 1.2.4染色.倒出电极缓冲液.取出胶室.卸下胶条,启开玻 璃板.取出胶片,浸入染色液中,室温染色4h.若希望染色速 度加快,也可适当提高温度. 2结果与分析 2.1玉米盐溶蛋白的谱带特征 大多数种子贮藏蛋白在多基因位点上编码.基因产物 显示几条蛋白带(黎裕,1990)181.在品种鉴定中.可根据特定 蛋白带的有无或者在电泳凝胶上某一位置出现的谱带评价 其特异性(见图1).不同的玉米品种由不同的蛋白质组成. 所以表现在电泳谱带上就有不同的谱带类型,玉米盐溶蛋 白电泳就是利用这些差异来鉴定品种的. 玉米盐溶蛋白电泳谱带可根据分子量大小划分为3个 区域:Of.区,p区,?区.Of.区由小分子量蛋白质组成,B区由 中分子量蛋白质组成,?区由高分子量蛋白质组成. B区为主要的谱带区域,该区域中蛋白质谱带数量多, 染色深,品种间差异大,为纯度鉴定中主要应