第11章 DNA文库的构建和目标基因的筛选.ppt

西南大学 生物技术专业 基因工程 * 从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.5 - 2.0 kb范围内 分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文库，杂交阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起 然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体DNA的端点 染色体走读法（chromosome walking） 西南大学 生物技术专业 基因工程 * 走读的起点克隆片段 亚克隆旁测序列 探针标记 第一轮杂交 阳性克隆 阳性克隆 第二轮杂交 第二轮杂交 西南大学 生物技术专业 基因工程 * 第四节 DNA文库的保存 文库的长期存在-80℃进行。 噬菌体文库的保存：繁殖一次，分成若干小份，加2%至3%的氯仿可在4℃下保存数月，或加7%的DMSO长期保存于-80℃。 落菌文库的保存：甘油贮存克隆子的菌液于-80℃。 文库阵列法：保存大片段文库。 第十一章 DNA文库的构建和目标基因的筛选 第一节 基因组DNA文库的构建 第二节 cDNA基因文库的构建 第三节 基因克隆的筛选策略 第四节 DNA文库的保存 基因库(gene pool)：特定生物体全基因组的集合(天然存在) 基因文库(gene library)：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。根据构建方法的不同，基因文库分为： 基因组文库：材料来自染色体DNA，含有全部基因组序列。 任何器官、组织、细胞、任何发育时期以及在任何环境下，基因组DNA是衡定的，所以用该生物的任何材料均可构建基因组DNA文库且具有一致性。 cDNA文库：材料来自mRNA，含有全部蛋白编码基因的cDNA，无启动子、终止子、内含子、基因间隔区等，序列信息量远小于基因组文库。 在高度分化的生物体中，不同器官、组织、细胞、不同发育时期以及对不同环境的应答中，mRNA种类和丰度不同，即表达谱不同，因此同种生物体的cDNA文库随表达谱变化而变化，用什么材料构建什么样的cDNA文库依研究目标而定。 西南大学 生物技术专业 基因工程 * 第一节 基因组DNA文库的构建 一、基因组DNA文库的类型和发展 1、质粒文库：容纳片段小于15kb，以菌落的形式保存和筛选，一般用于对大片段文库的亚克隆，用于鸟枪法测序等。 2、噬菌体文库：一般用λ载体，插入型容纳片段小于7kb，适合于构建cDNA文库，置换型容纳9-25kb，适合于构建亚克隆文库或直接构建基因组文库。 3、粘粒文库：一般用于直接构建基因组文库，最长插入片段比λ文库略长，达45kb左右。 4、人工染色体文库：有细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)、P1人工染色体(P1 artificial chromosome, PAC)等文库，最大插入片段分别为300kb、1000kb和300kb，是大片段文库，主要用于基因组测序和图谱构建。 西南大学 生物技术专业 基因工程 * 5、亚基因组文库：文库的对象只是基因组的一部分，可用染色体显微切割、PFGC特定片段回收、特定YAC富集等方法而产生，用于针对特定目标基因对大片段文库的深入研究。 6、基因组文库的发展：略 二、文库的代表性和随机性 代表性意味着文库要有完备性，是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )。其中：P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小 。 例：人的单倍体DNA总长为3.2 x 109 bp，假如文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆。 随机性既表示构建文库时要从基因组DNA获得随机断裂的片段，也表示构建好的文库中所有基因要有相等的筛选概率。 基因文库的质量标准 除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件： 1、重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力； 2、载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序和染色全步查； 4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆； 5、重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失真度小。 1、基因组DNA的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程