跨膜型TNF-α介导乳腺癌阿霉素抵抗及分子机制-分子免疫学专业论文.docxVIP

华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 中文摘要 TNF-α是一个具有广泛生物学功能的细胞因子，以两种生物活性形式存在， 即 26kD 的跨膜型 (transmembrane TNF-α, tmTNF-α)和 17kD 的分泌型 (secreted TNF-α，sTNF-α )，后者由 TNF-α转化酶(TNF alpha-converting enzyme TACE)酶 切 tmTNF-α胞外段而形成。两型 TNF-α的分子结构，受体亲和力以及作用方式 均不同，因此，二者的功能不尽相同。目前，关于 sTNF-α的生物学功能有大量 报道，而 tmTNF-α的生物学功能却报道较少。tmTNF-α不但可与受体结合，通过 正向信号对靶细胞发挥生物学效应，而且 tmTNF-α本身也可作为受体，通过反 向信号对 tmTNF-α表达细胞发挥效应。 近年来，肿瘤微环境内源性 TNF-α作为一种关键性炎症因子参与肿瘤的发 生发展引起广泛关注。乳腺癌患者血浆 TNF-α升高，且常预后差。在 HER2 转基 因小鼠中阻断 TNF-α可抑制肿瘤生长。本课题组前期研究证实导管浸润性乳腺癌 高表达 tmTNF-α，且转染 tmTNF-α信号肽（LS）可使 sTNF-α敏感的 MCF-7 乳 腺癌细胞转变为耐受株，提示 tmTNF-α可能通过其反向信号导致肿瘤细胞抵抗 凋亡。那么，tmTNF-α是否也能通过其反向信号诱导乳腺癌细胞抵抗化疗呢？如 是，其机制如何？关于这些问题至今尚未见到相关报道。 本研究通过体外实验证实 tmTNF-α与阿霉素耐药间关系，并阐明其分子机制。 通过在体干扰 TNF-α表达，进一步验证 tmTNF-α在乳腺癌中的病理作用及诱导 肿瘤耐药的作用；为提高乳腺癌化疗和敏感性提供实验依据，为乳腺癌和其它肿 瘤的治疗提供新的思路和靶点。 第一部分 tmTNF-α介导乳腺癌阿霉素抵抗 及其机制的体外研究 1. 高表达 tmTNF-α 乳腺癌细胞对阿霉素耐药：用流式检测证实 MCF-7 几 乎不表达 tmTNF-α，而 MDA-MB-231 则高表达 tmTNF-α（76%）。给予不同浓 度的阿霉素处理 48 小时，MTT 与 DNA 片段化结果显示不表达 tmTNF-α的 MCF-7 细胞对阿霉素敏感，而高表达 tmTNF-α的 MDA-MB-231 细胞则对阿霉素诱导的 凋亡发生抵抗。提示：tmTNF-α可能与乳腺癌细胞对阿霉素抵抗相关。 2. 抑制 TNF-α 表达增强 MDA-MB-231 对阿霉素的敏感性：稳定转染 TNF-α shRNA 可使 MDA-MB-231 tmTNF-α的表达率从 76.3%下降到 21.5%，并 明显增加其对阿霉素诱导凋亡的敏感性。提示 TNF-α可能导致 MDA-MB-231 对 阿霉素的耐药。 3. 过表达 TNF-LS 降低 MCF-7 细胞对阿霉素的敏感性：为排除正向信号 以及 sTNF-α的影响，我们稳转 tmTNF-α信号肽（leader sequence，LS）于不表 达 TNF-α 的 MCF-7 细胞，结果使该细胞由阿霉素的敏感株变为耐药株。提示 tmTNF-α通过反向信号诱导对 ADM 的耐药。 4. tmTNF-α介导乳腺癌阿霉素耐药与 MDR1、BCRP 和 MRP1 表达无关： ABC 类家族的药物转运蛋白分子是导致 ADM 耐药最常见的原因之一。我们采 用 Real-time PCR 发现过表达 TNF-LS 或干扰 tmTNF-α的表达，对两株乳腺癌细 胞耐药基因 MDR1、BCRP 和 MRP1 的 mRNA 水平无影响；同样，阿霉素处理 也未见明显改变（p0.05）。我们应用 FCM 证实 MDR1 的蛋白水平与其转录水 平一样，未见明显改变。上述结果提示 tmTNF-α介导的乳腺癌细胞阿霉素耐药 可能与上述耐药基因的表达无关。 5. tmTNF-α不影响乳腺癌细胞表达 HER2：因为 HER2 过表达是促进乳腺 癌细胞增殖和化疗抵抗的重要分子，我们应用 FCM 证实：转染 TNF-LS 对 MCF-7 表达 HER2 无影响，且阿霉素处理后无明显改变，提示 HER2 表达可能不受 tmTNF-α的影响。 6. ERK 信号通路参与 tmTNF-α介导乳腺癌阿霉素耐药：ERK1/2 是常见的 促生存而导致化疗耐药的信号途径之一。用 WB 方法证实 MCF-7 转染 TNF-LS 可促进 ERK1/2 组成性磷酸化。下调 tmTNF-α 后可抑制 MDA-MB-231 ERK1/2 组成性磷酸化；用 ERK1/2 抑制剂 PD8059 可拮抗 tmTNF-α 反向信号的作用，逆 转 MCF-7/TNF-LS 和 MDA-