辣椒素抗动脉粥样硬化的实验研究-药理学专业论文.docxVIP

贵阳医学院 20 贵阳医学院 2011 届研究生毕业论文 辣椒素抗动脉粥样硬化的实验研究 PAGE PAGE 10 材 料 与 方 法 1．实验动物 实 验 材 料 健康豚鼠 SPF 级 ，体质量 250±30g ， 雌雄各半，由重庆市中药研究院实 验动物研究所提供，许可证号：scxk(渝)2007-0006，合格证编号：0003714。 0.3%胆固醇高脂饲料由（重庆市中药研究院实验动物研究所提供）。动物分笼饲 养，3 只一笼。自由饮水，室温 18～24℃，相对湿度 60～75%。 2．主要药品与试剂 辣椒素 安顺市百花串食品有限公司 辛伐他汀 成都天银制药有限公司MDA试剂盒 南京建成生物工程研究所 SOD试剂盒 南京建成生物工程研究所 NO试剂盒 南京建成生物工程研究所 TG试剂盒 浙江东欧生物工程有限公司 TC试剂盒 浙江东欧生物工程有限公司 内皮型NOS抗体 武汉BOSTER公司 诱导型NOS抗体 武汉BOSTER公司 PBS缓冲液 武汉BOSTER公司 枸橼酸盐缓冲液 北京中杉金桥生物技术有限公司 ZLI-DBA显色试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司 PV-6001 北京中杉金桥生物技术有限公司 ET-1 试剂盒 R．D公司 水合氯醛（化学纯） 上海山浦化工有限公司 生理盐水 贵州益佰注射剂制药有限公司3. 主要仪器 全自动生化分析仪 奥林巴斯AU5400 721分光光度计 上海第三分析仪器厂 光学显微镜 Olympus(BX50) 台式离心机 德国Hettich公司 XW-80型漩涡混匀器 上海医科大学仪器厂 恒温水浴箱 北京长源实验设备厂 AB-104-N型电子天平 北京赛多利斯电子有限公司 -80℃超低温冰箱 美国Foyma 紫外分光光度计 北京光学仪器厂 80-2型离心沉淀机 上海手术器械厂 Biomias2001图象分析系统 四川大学图象图形研究所 超净工作台 苏州净化设备有限公司 4．辣椒素溶液的配制 取辣椒素100mg溶于95%的乙醇0.1ml，溶解后用生理盐水定容至100ml,配成浓 度为1mg/ml，贮于冰箱中备用 。 实 验 方 法 1.动物模型的复制与给药（12） 48只豚鼠，在适应性喂养7d后，随机分为6组，正常对照组、模型组、辣椒素 高剂量组、中剂量、低剂量组、辛伐他汀组，每组8只，分笼喂养，自由饮水 。 因豚鼠的维生素C自身不能合成 ， 必须从饲料中获取，故在所有动物的饮水中 均加入5mg /100g体质量维生素C。除正常对照组每天给药普通饲料外，其余各组 每日给予高脂饲料 ( 普通饲料+0 .3 ％胆固醇+5% 猪油)66g/kg后再给予普通饲 料，共饲养14周，同时上述各组灌胃给予药物，每日1次。实验14周末，禁食12h， 自由饮水，动物麻醉后取血，分离血清，-80℃冰箱保存备用。处死动物，取主 动脉、肝脏组织，做相关指标检测。 2．指标检测 2.1 肝组织和主动脉组织病理组织学检查 动物处死后，取动物肝脏及主动脉，剥离主动脉根部至主动脉弓部的动脉置 于10%的福尔马林溶液中，进行石蜡切片，常规脱水、石蜡包埋后切成4um的薄 片，HE染色后观察病理形态学改变。 2.2 血清脂蛋白水平和肝脏脂质测定 动物麻醉后取血，将血液静止放置 2h，离心 3000r/min ×1 0min，分离血清，采 用全自动生化仪检测血清中的 TC、TG、LDL、HDL、载脂蛋白 B（apoB100）。取 肝脏同一部位组织称重，按 1：9（每克肝组织加 9ml 冰生理盐水）的比例制成 10% 的组织匀浆，制备匀浆过程始终处于冰水中，离心 3500r/min×15min,取上清液，用 全自动生化分析仪检测 TC、TG 含量。 2.3 血清MDA、SOD测定 采用TBA法测定丙二醛( MDA)，黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶（SOD） 活性。 2.4 血清中NO、ET-1的检测 采用硝酸还原酶法测定血清中一氧化氮（NO）含量。采用酶联免疫吸附实验 （ELISA）法测内皮素（E