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广州辉骏生物科技有限公司 Pull down 一、原理 Pull-down又叫做蛋白质体外结合实验，是在外源条件下检测蛋白质间相互作用的方法。基本原理：将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当 “诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的结合蛋白，洗脱结合物后通过SDS电泳分析，验证两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白；“诱饵蛋白”一般采用原核表达（也可以通过其他方式）获得，而“捕获蛋白”可以是细胞裂解物、纯化蛋白或表达系统获得的蛋白。 二、实验流程 构建带标签的诱饵蛋白原核表达载体（带his或GST标签）； 载体转化大肠杆菌，表达诱饵蛋白（这一步比较关键，很多蛋白原核表达会形成包涵体，极大影响后续实验，我们采用自诱导培养基培养细菌，使得包涵体形成的几率大大降低）； 裂解细菌，裂解液过柱子（特异结合his或GST标签）； 待测样品裂解，裂解液过柱子，互作蛋白被吸附在柱子； 清洗，离心，去除未结合的杂蛋白； 洗脱，得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物； 下一步根据实验目的可以去做Western blot或质谱 如要验证某个蛋白X与诱饵蛋白互作，则拿上一步的蛋白复合物去孵育X的抗体，做Western blot； 如要寻找诱饵蛋白的所存在的可能的互作蛋白，则拿上一步的蛋白复合物去做LC-MS/MS，对照组、实验组的复合物分别做LC-MS/MS； 三、结果 GST：对照； GST：对照； GST-X：实验； Y：目的蛋白溶液 图1 pull down验证两个蛋白互作结果 Pull down寻找互作蛋白的结果是两组质谱结果，可参考TAP/MS的结果。