113第十一部分遗传物质的分子基础.pptVIP

第五节 遗传工程 一、细胞工程 在离体（in vitro）条件下以细胞为基本单位，借助人工培养基，对生物细胞进行培养、繁殖，或者使其发生变异，从而改良生物品种、创造新品种、加速繁育，或利用细胞培养生产有用物质的过程。 细胞工程包括细胞培养、细胞融合、细胞器转移、生物体的克隆与规模化繁殖等。 二、酶工程 利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品。 是酶学理论与化工技术相结合的新技术体系。 三、发酵工程 利用微生物与现代化工程技术相结合，工厂化生产人类需要的物质的一种技术体系。 目前医用抗生素、农用抗生素绝大部分都是发酵工程产品。 四、基因工程 利用人工方法在体外（in vitro）切割、拼接、重组生物的遗传物质，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改良。 基因工程操作的对象是DNA分子。 又称为重组DNA技术 重组DNA技术流程 酶切与连接 质粒载体①分子量小(2.69kb),但能携带较大的外源片段；②拷贝数多,在每个宿主细胞可达500个；③酶切位点多，克隆方便；④具有α-互补显色表型,便于检测。 λ噬菌体（30kb） * ●遗传工程是指利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或更适合人类需求的产品的遗传学手段。 广义遗传工程和狭义遗传工程 广义：包括细胞工程、基因工程、酶工程和发酵工程等。 狭义：基因工程。 第一个哺乳动物的克隆——Dolly羊 ●基因工程的基本步骤： 1.目的基因的分离或合成 2.将目的基因与载体DNA连接，构建重组DNA分 子-表达载体 3.将重组DNA分子导入受体细胞，在其中扩增和表达。 一、工具酶 1、限制性内切核酸酶 限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列 的磷酸二脂酶 Ⅰ型酶：仅EcoB和EcoK两种，催化限制 性切割和修饰核苷酸2种功能 Ⅱ型酶：遗传工程中应用最广泛 Ⅲ型酶：具有特异的识别位点，识别位 点是非对称的 Ⅱ型限制性酶的基本特性： ①有特异识别和切割的序列部位 ②DNA分子上两个单链断裂的部位通常不是直接相对的 ③ 断裂所形成的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末端） ④内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催化所完成，即内切酶活性和甲基化作用活性是分开的 限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接 回纹序列 限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点 平齐末端 2、DNA连接酶 DNA连接酶是重组DNA分子构建必不可少的工具酶，能催化DNA中相邻的3’ –OH和5’ – 磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来 3、反转录酶 反转录酶是一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，故又称依赖于RNA的DNA聚合酶 通常用反转录酶构建cDNA文库（cDNA library） 4、聚合酶链式反应(PCR) PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的Mullis(1986)发明, 1993年诺贝尔化学奖 PCR可对特定DNA片段进行扩增，且可用痕量DNA作模板，对DNA纯度要求也不高,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝 PCR反应在一种混合液中进行，该混合液包括四种主要成分：两个引物（一般为20 bp）、模板DNA、热稳定的DNA聚合酶（Taq酶，在95℃甚至更高的温度下活性稳定）和四种脱氧核苷酸。PCR反应在PCR仪上自动进行 PCR反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤： 1）变性：95℃，DNA双链 分离成单链 2）退火(复性)：55℃左右 ，引物与单链的模板DNA 序列互补结合 3）延伸：72℃左右Taq ， 酶通过在引物的 3’-OH端增加碱基的办法 使引物延伸 表12-2 PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系 1073741824 230 30225 25 1048576 220 20 32768 215 15 1024 210 10 32 25 5 2 21 1 PCR产物拷贝数 循环数 二、载体 常用载体： 细菌质粒、噬菌体、病毒等。 细菌人工染色体（BAC） 酵母菌人工染色体（YAC） 人类人工染色体（HAC） * * * * *