形态学研究及其方法进展.ppt

3.3 间接法原位PCR 特点：PCR体系中dNTP和引物均不标记 PCR扩增结束后用标记探针行原位杂交 标记物：以生物素、地高辛较为常用 操作程序： 组织细胞制备：固定、预处理 渗入和原位扩增：dNTP，引物, Taq DNA聚合酶 扩增产物检测：ICC 原位杂交： 用特异性标记探针 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 评价：目前最常用 优点：扩增效率高 特异性强（杂交探针特异性结合靶序列，不与扩增 产物中的非靶序列结合） 可用于细胞制备和石蜡切片标本 缺点：操作复杂 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 举例：石蜡切片，Dig标记 标本制备：10%福马林固定，石 蜡切片5 ?m。 预处理： ①脱蜡至水; ②0.2mol/L HCl，10’; ③5 ?g/ml 蛋白酶K 37℃ 10’; ④RNase消化37℃ 30’; ⑤Alc脱水干燥。 原位扩增： ①PCR扩增反应液30 ?l，加盖片封边; ②PCR热循环：94℃ 1’，55 ℃ 1’， 72℃ 1.5’， 25-30个循环， 72℃延伸 10’； ③去盖片，4%多聚甲醛后固定10’； ④ Alc脱水干燥。 原位杂交： ①Dig标记探针，98 ℃变性10’，-20 ℃退火5’，42 ℃