酶工程 第七章 酶分子定向进化.ppt

第七章 酶分子定向进行 酶分子定向进化（enzyme molecular directed evolution）是模拟自然进化过程（随机变异和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。 简称酶定向进化（enzyme directed evolution） 分子定向进化 以各种生物大分子为进化对象，目的是改良目标分子的结构、功能和特性，主要包括： 酶分子定向进化 蛋白质定向进化 核酸分子定向进化。 定向进化示意图 天然酶的局限 酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求 稳定性差 活性低使催化效率很低 缺乏有商业价值的催化功能 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。 现代生物工程对酶的要求 能具备长期稳定性和活性 能适用于水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料 酶定向进化的基本过程 基因的随机突变 定向选择 第一节 酶基因体外随机突变 第二节 酶突变基因的定向选择 第三节 酶分子定向进化的应用 第一节 酶基因体外随机突变 基因体外随机突变方法的特点 一、易错PCR技术 易错PCR技术(error-prone PCR)是从酶的单一基因出发，在改变反应条件下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。 (1)易错PCR反应过程 ① 双链DNA变性：85-95℃ ② 引物与单链DNA退火结合：50-70℃ ③ 引物延伸：70-75℃ (2)易错PCR反应条件 ① Mg2+浓度较高，以稳定非互补的碱基对。普通PCR Mg2+浓度0.5-2.5mmol/L，易错PCR提高Mg2+浓度。 ② 添加Mn2+ ，以降低聚合酶对模版的特异性。 ③ 4种底物的浓度比改变，即采用浓度不平衡的各种底物，使碱基配对错误出现频率增加。 易错PCR示意图 易错PCR, 遗传变化只发生在单一分子内部, 所以属于无性进化（asexual evolution）。 采用易错PCR时，要控制好适当的突变频率。 突变频率太低，难于筛选到理想的正突变体 突变频率太高，增加筛选工作量（大多突变为负突变和中性突变） 一般情况下, 一个目的基因通过易错PCR引起的错配碱基数目控制在2-5个。 通常采用连续易错PCR ( Sequential error prone PCR) ： 将一次PCR 扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR 扩增的模板, 连续反复进行随机诱变。 Chen.K和Arnold在 1993年采用易错PCR对该枯草杆菌蛋白酶进行了体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP的浓度,对编码该酶从第49位氨基酸到C端的DNA片段进行易错PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺(DMF)中酶活性明显提高,其中突变体PC3在60%的DMF中,酶活力是野生型的256倍。将PC3再进行两个循环的定向进化,得到的突变体酶活力比PC3还要高3倍。 易错PCR特点： 操作简便，随机突变丰富 正突变概率低，突变基因文库较大，筛选工作量大 适合较小基因（＜800bp）的定向进化 二、DNA重排技术 DNA重排（DNA shuffling）技术又称DNA改组技术，是从两种以上的同源正突变基因出发，用酶切成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。 此方法又称为有性PCR(Sexual PCR),通过将亲本基因群中的突变尽可能组合在一起,以导致更大的变异,最终获得具有最佳突变组合 1994年由Stemmer等人首次提出，使用该技术使β-内酰胺酶定向进化，催化效率提高32000倍。 DNA shuffling 其基本操作过程 : （1）靶基因经随机突变产生含不同突变类型的亲本基因群, 用DNase I 随机切割; （2）得到的片段经过不加引物的多次PCR 循环, 在该过程中, 这些片段之间互为引物和模板进行扩增, 直至获得全长基因; （3）再加入基因的两端引物进行常规PCR, 最终获得发生改组的基因库。 DNA 重排技术特点 正突变体概率高，进化速度较快 在获得全长基因之前要除去DNase I。 DNA重排技术的改进 交错延伸PCR技术 随机引物体外重组技术 1、交错延伸PCR技术 交错延伸PCR (Stagger extension process PCR，StEP)是在PCR 反应中, 将含不同点突变的模板（两个或多个DNA片段）混合, 将常规的退火和延伸合并为一步, 并大大缩短其反应时间（55℃，5s）, 从而只能合成出非常短的新生链, 经变性的新生链再作为