感染性疾病的分子生物学检验.ppt

课程内容 病毒性疾病的临床分子诊断 细菌性疾病的临床分子诊断 特殊病原体的临床分子诊断 医院感染的临床分子诊断 传统病原体的检验程序 微生物学检验 发现传染源的最主要手段 病原体诊断的金标准 检测时限长（2～42天） 某些病原体不能被培养 受多种因素影响 分子诊断 严格病原体 不可培养或难以培养的病原体 需要快速得到检验结果 需要获得定量数据 乙型肝炎病毒的复制周期 结核分枝杆菌 1.生物学特性与致病性 结核分枝杆菌复合群包括人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，其中前三者对人类致病 人型结核分枝杆菌感染的发病率最高 生长与病理特征 结核分枝杆菌生长缓慢，增殖一代需15－20小时，生长成可见菌落一般需4－6周 在组织细胞内大量繁殖引起炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及菌体成分诱发的机体免疫损伤 结核分枝杆菌 2.基因组特点 共价封闭环状结构 标准株结核分枝杆菌基因组全长4.4Mb,包含4000个蛋白质编码基因和50个RNA编码基因 基因组特征 (1)重复序列：如IS6110，仅存于结核分枝杆菌复合群细菌染色体上长1355bp的重复插入序列，具有复合群特异性 (2)蛋白质编码基因 (3)rRNA基因：每个细胞约含有103－104 个rRNA，含有结核分枝杆菌高度保守的序列，也有分枝杆菌种特异性序列 结核分枝杆菌的检测 实验室检查手段主要包括标本直接涂片染色镜检、分离培养鉴定以及血清学抗原检测方法 分子生物学理论和技术已经用于分枝杆菌的分子结构和功能的研究中，并开始用于临床菌种和耐药株的鉴定及监测 分子生物学检验方法 聚合酶链反应(PCR) Real-time PCR 染色体核酸指纹法 线性探针杂交法 16s～23srDNA(rRNA)序列法 基因芯片技术 线性探针耐多药检测方法（HAIN） 适用范围： 1、TB的诊断 2、一线抗结核药物耐药诊断 3、二线抗结核药物耐药的诊断 4、目前，利福平（rpoB基因） 、异烟肼（Kat基因、inhA基因）耐药的诊断 所需仪器设备：生物安全柜、超声振荡仪、PCR扩增仪、可调温振荡仪 原理：基于分子生物学扩增与探针技术。 rpoB基因突变位点有：4个 Kat基因、inhA基因突变位点有：2个、4个 正确流程 操作步骤 一、痰标本处理 去污染前处理液：氢氧化钠+柠檬酸三钠+N-乙酰半胱氨酸。 痰标本+等体积去污染前处理液：振荡-离心-静置-PBS清洗-离心-留取沉淀。 二、DNA提取 处理后痰标本沉淀 ： 95°C孵育-超声裂解-取上清液用于PCR扩增。 三、扩增产物杂交 PCR产物变性，与探针试条上的标记突变位点杂交，标记物显色。 四、结果判读 HAIN和目前常规药敏方法比较 适用范围： 1、TB复合群鉴定。 2、TB菌种鉴定。 3、利福平和异烟肼耐药检测 。 原理：多重PCR扩增和反向杂交来识别。 基因芯片 将核酸片段有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列。 采用光导原位合成或微量点样等方法。 与已标记的待测生物样品中靶分子杂交。 通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。 耐药检测基因芯片 基因芯片是基于特定基因位点突变与耐药性的相关性，通过PCR扩增和核酸杂交技术，检测荧光信号的有无，判断特定位点的突变情况和细菌耐药性的检测方法。 结核分枝杆菌耐药检测基因芯片基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌耐药性（利福平、异烟肼）。 rpoB基因突变位点：13个位点。 katG基因突变位点：2个位点。 /inhA基因突变位点：2个突变位点。 耐药分子诊断的基本原理 结核和利福平耐药的快速分子鉴定（x-pert） 适用范围： 1、TB复合群鉴定。 2、利福平耐药检测 。 原理：多重PCR扩增和反向杂交来识别。 可以在2小时出报告结果。 第四节 医院感染的临床分子诊断 住院患者在医院内获得的感染 易感人群包括婴幼儿、基础疾病患者和有危险因素者 分布有显著地区差异 常为多重耐药菌，治疗难度大 检验的关键是了解院内病原菌的分布和亲缘关系 PFGE 动物、肉类和人的多重耐药Newport沙门菌分离株的PFGE图谱 分型的基础：细菌基因组内位于同一位点的看家基因的片段是否存在变异 看家基因的测序 不同的等位基因指派一定的数值，生成等位基因谱 每个等位基因谱认定为一个序列型（ST） 进化树确定亲缘关系 eBURST 软件分析菌株之间的亲缘关系 人乳头瘤病毒（HPV）是一种嗜上皮性病毒，具有高度的组织