本科生分子医学技能1实验室操作规程及注意事项.ppt

亲和层析（affinity chromatography） 应用 分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能 + 待纯化分子 配体 a. 待纯化分子和配体间具有亲和性 + 基质 b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂 + + 杂质 c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离 + d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子 原理： 基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex 亲和层析演示 聚焦层析（Chromatofocusing） 该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。 层析时的聚焦效应示意图 pH梯度溶液的形成示意图 蛋白质1（pI=7） 蛋白质2（pI=8） 流速 移动速率 凝胶层析又称凝胶过滤或分子筛层析，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子无法进入凝胶颗粒中的静止相中，只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中，因而以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。 凝胶过滤层析 分子筛层析（gel-filtration chromatography） 原理 基质 葡聚糖凝胶（sephadex） 琼脂糖凝胶（sepharose） 应用 测定分子量 脱盐和浓缩 分离提纯生物大分子 除去热原物质 分子筛层析演示 内水 Vi 外水 Vo Ve＝ Vo Vt＝Vo+Vi+Vg Kd＝ Ve－Vo Vi ＝ 0 内水 Vi 外水 Vo Ve＝ Vo＋Vi Vt＝Vo+Vi+Vg Kd＝ Ve－Vo Vi ＝ 1 内水 Vi 外水 Vo Ve = Vo＋Vx Vt＝Vo+Vi+Vg Kd＝ Ve－Vo Vi ＝ Vx/Vi 1 棱镜 光波通过棱镜时，不同波长的光折射率不同， 折射率与波长成负相关。 衍射光栅 在石英或玻璃的表面刻划许多平行线，通过光的干涉和衍射，形成光谱。 3. 狭缝 由一对隔板在光通路上形成的缝隙，通过调节缝隙的大小调节入射单色光的强度，以适应检测器的需要。 棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同 单色器 入射狭缝 准直透镜 棱镜 聚焦透镜 出射狭缝 白光 红 紫 λ1 λ2 800 600 500 400 4. 吸收池 （或称比色杯、比色皿、比色池） 一般由玻璃或石英制成 注意：a. 与光束垂直；b. 规格相同；c. 清洁 5. 检测器 光 电，并逐级放大 6. 测量装置 电流表、记录器和数字示值读数单元 722型分光光度计结构方框图 光源 吸收池 检测系统 分光系统 吸光度与浓度的关系 A = ?bc 吸光度 0.00 光源 检测器 吸光度 0.22 光源 检测器 b 吸光度 0.42 光源 检测器 b 利用分光光度法对物质进行定量测定的方法。 （一） 标准曲线法 （二） 标准管法 分光光度法在生物化学中的应用 （一） 标准曲线法 配置浓度递增的标准溶液（C），在最大吸收波长（ ? max）处测得各个吸光度（A），绘制标准曲线（A-C曲线）。 在测定被测样品时，以相同条件在? max处测定A值，从标准曲线上查得该样品相应的浓度。 0 1 2 3 4 mg/ml A 。 。 。 。 * 0.8 0.6 0.4 0.2 0 溶液浓度的测定 A＝ ?bc 工作曲线法 (校准曲线) 朗伯-比尔定律的分析应用 A C A1 待测液浓度 （二） 标准管法 在相同条件下测定已知浓度（C标）标准溶液的吸光度 （A标），同时测定未知浓度（C样）样品溶液的吸光度（A样），根据Lambert-Beer定律：