第部分酶免疫技术.pptVIP

章酶免疫技术 节　酶免疫技术的特点 　一、酶和酶作用底物 　二、酶标记抗体或抗原 　三、固相载体   第二节酶免疫技术的分类 一、均相酶免疫测定 二、非均相酶免疫测定 第三节　酶联免疫吸附试验 一、基本原理 二、方法类型及反应原理 思考题 小结 放射免疫技术 发光免疫技术 酶免疫技术 三大经典标记技术 三大经典标记技术 第一节 酶免疫技术的特点 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性 抗原抗体反应的特异性 + 酶高效催化反应的专一性 原理及特点 特点： 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的新方法。 原理： 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析 原理及特点 标记酶的要求： 活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 一、酶和酶作用底物 辣根过氧化物酶（HRP） 糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 纯度用RZ(纯度数)值：403nm （辅基）　　　与275nm（主酶） 　　　OD(吸光度)值之比 RZ值与酶活性无关，酶活性单位U比RZ值更为重要 ELISA中应用最为广泛的标记用酶 常用酶 酶和酶作用底物 优点 容易提取 价格低廉 性质稳定，耐热，与抗原抗体偶联后活性很少损失 碱性磷酸酶（AP） 菌源性AP 肠粘膜AP β–半乳糖苷酶（β-Gal） 用于均相酶 免疫测定 常用酶 酶和酶作用底物 HRP的底物 DH2+H2O2→ → → D+2H2O HRP 供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种 H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高 常用底物 酶和酶作用底物 邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB 5-氨基水杨酸5-ASA 2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS 常用底物 酶和酶作用底物 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。 　HRP的常见底物 酶和酶作用底物 AP的 底物 β-Gal 的底物 对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ） 4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（ 4MUG ） 经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。 酶作用后，生成高强度荧光物 ，用荧光计 测量。 常用底物 酶和酶作用底物 酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（conjugate） 酶标记物 通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的 结合物 二、酶标记抗体或抗原 抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。 制备方法要求 酶标记抗体或抗原 制备方法要求 技术方法简单、产率高，重复性好 标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性 酶标记物稳定 ，不形成聚合物 酶标记抗体或抗原 制备方法 过碘酸钠法（直接法） 常用于HRP标记抗体或抗原 戊二醛交联法 酶标记抗体或抗原 戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。 酶标记抗体或抗原 纯化及鉴定 标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度 常用的纯化方法： 葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化 50%饱和硫酸铵沉淀提纯 酶标记抗体或抗原 固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面 三、固相载体 要求 结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济 种类 塑料制品 微颗粒 膜载体 固相载体 将抗原或抗体结合于固相载体 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附 包被coati