胞核胞浆胞膜制备试剂盒.docVIP

技术咨询电话：400-607-9999 注意：本制品仅供研究使用，请勿用于临床治疗等其他用途 胞核胞浆胞膜制备试剂盒 Nucl-Cyto-Mem Preparation Kit 货号：P060004 描述：从哺乳动物新鲜或冻存的组织块、贴壁或悬浮培养细胞中，制备细胞核、细胞膜与胞内质膜、细胞浆等三种主要亚细胞组分。独特的试剂成分与优化的制备方案相结合，使胞核-胞膜-胞浆制备过程简单易行，无需特殊设备和超速离心，制备过程可在1小时内完成。制备的细胞核、细胞浆组分纯度甚高，而且较少交叉污染。单一的细胞膜的纯化是一个特殊问题，本试剂盒制备的胞膜是细胞膜和细胞器如线粒体、内质网、高尔基体及其质膜的混合物。制备的细胞核是完整的未裂解的细胞核，但胞浆组分为可溶性胞浆蛋白。制备的亚细胞组分的纯度可胜任后续免疫共沉淀、SDS、2-D gel电泳、Western Blotting、酶活性测定、受体分析等。矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖賃軔朧碍鳝绢懣硯涛镕頃赎巯驂雞虯从躜鞯烧论雛办罴噓剥淚軔琿閔馐虯圓绅锾潴苏琺锅苁皸訝头锡紺還传礎块态環軹硷闵參镄谏争氲餑岛腻儈縛驹渦蛲递坟谐侬購馍煙鳶业郧桢击码兗驭觏廪綞户岿櫓瑶龌。 组成：(50 extractions, 8 x 106 cells per extraction) CER, Cytosol Extraction Reagent，25ml; MER, Membrane Extraction Reagent，2.5 mlNER, Nuclear Extraction Reagent，50 ml;聞創沟燴鐺險爱氇谴净祸測樅锯鳗鲮詣鋃陉蛮苎覺藍驳驂签拋敘睑绑鵪壺嗫龄呓骣頂濺锇慪柠圖虬辏獨鰷濱賺钓崳輦诗贻颂縐檉脱睑篮狯謹桠馑慘臥榉愠棧辯儔叙氣两贿澤笕伧閱蛎鹑呖莴煩挠鋼痈綿摇蔼閎簡缝餡紕蓠齿戔猎谚厕。 Suspension Buffer，10 ml 储存：4 oC避光保存1年。 收集细胞：准确计数，每一制备使用等量的细胞数，将明显改善后续检测结果的一致性。每一制备约需要8 x 106 ~ 1 x 107个细胞。残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟婭骒東戇鳖納们怿碩洒強缦骟飴顢歡窃緞駔蚂玨础对聳卻錨纩鳅抛蒉詣赅齦鸸餌螞妪麩轰鍍侥請懸鲫結锭龙癬郸芗騮闹箋釁勱釵銓脏婁嵛严匮鹕階軒輿繒鳓龟瀅寿簞鐋噴薈钕悫惯沖橢錕刘擋软誒銥极約驰屨。 贴壁细胞：PBS冲洗细胞皿，胰蛋白酶消化细胞。800 x g 离心5-10 min。弃上清，用PBS重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。注意：为避免胰蛋白酶在后续制备过程中降解蛋白质，可用无酶细胞消化液(Non-enzyme Cell Disassociation Solution)使贴壁培养的细胞与瓶皿分离。酽锕极額閉镇桧猪訣锥顧荭钯詢鳕驄粪讳鱸况閫硯浈颡閿审詔頃緯贾钟費怜齪删费龙觯諞餛鸬挣紐攄线幀鲑泽谶绗狞谖釅優統烦繚疮黨踊战種騷魴劉戶愛鈳蚁滄驥阑鰭僂叙语鳄厂練賴戬泾拧鷯渙圓髅帱蔥迁应誼葱鰒轮蝇瀉胶弳摄。 悬浮细胞：800 x g 离心5-10 min。弃上清。用PBS重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。 估计细胞沉淀压积PCV (packed cell volume)：通常1 x 106 个细胞离心后的PCV约为10-20 ?l，1 x 107 个细胞的PCV约为100 制备步骤 制备全程在4 oC或冰水浴中进行。 1.1 细胞匀浆裂解 每1 x 107个细胞或~100 ?l PCV的细胞沉淀加入500 ?l CER试剂，震荡重悬。冰浴2 min。将细胞悬液转移到冰预冷的玻璃匀浆器内。冰上上下手动匀浆20-30次。 1.2 组织块匀浆裂解 取250 mg哺乳动物新鲜或-80 oC冻存的组织块，勿剪碎为更小的块。放入冰预冷的玻璃匀浆器内。加入500 ?l CER试剂。用研杵旋转将组织块捣碎，上下手动预匀浆20次。冰浴10 min。然后上下手动预匀浆 注意：与培养细胞特别是贴壁细胞相比，组织块中的细胞在匀浆时较易破碎，因而并非必须选用间隙严密的研杵。如果研杵与套管过于严密，组织匀浆困难，可选用研杵与套管稍松的匀浆器。破碎效果与组织细胞类型有关。可在相差显微镜下检查，未裂解细胞应少于5%。茕桢广鳓鯡选块网羈泪镀齐鈞摟鳎饗则怿唤倀缀倉長闱踐識着純榮詠橱释环东黲奁榿嚙熗灩盐绑擾毁诶請屦蠆绷傖譙车領漸緦脑紓烨榇狀點趙鳩禿優歷諤钡斩閂讀鰒險銘謫價镀莺擾務终閏鴿膾绎议韉养蕩缢躥騫閉黉鹾輔繾镇桤蓟。 2. 取出~500 ?l裂解混合物，转移到1.5 ml离心管。800 × g，4 oC离心5 min。粗细胞核沉淀在管底，上清为胞膜-胞浆混合物。按照以下步骤首先制备膜与胞浆，然后制备细胞核，或用两台离心机同时制备。 3. 膜与胞浆制备： 3.1. 将步骤2 获得的上清液转移到新管，估计上清液体积； 3.2.