循环DNA的临床应用研究进展.docVIP

循环DNA的临床应用研究进展 摘 要：循环DNA（circulating DNA）是存在于血液（血浆或血清）、滑膜液、脑脊液等体液中的细胞外DNA，其量和性质的改变在肿瘤、感染性疾病、产前诊断、创伤和自身免疫性疾病的诊断和预后判断以及器官移植的监测等方面具有重要意义。 关键词：循环DNA 诊断 预后 早在1948年，法国学者Mandel和Metais1便发现了人类血液循环系统中游离于细胞外的核酸物质——循环DNA的存在。但在其后的近30年时间内，对于循环DNA的研究只局限于自身免疫性疾病2，而且，其定量检测也仅仅限于基于DNA抗体的放射免疫技术3、4。1975年，Steinman5等采用四种不同的检测方法确定正常成年人血浆血清DNA含量在10-30ng/ml范围内，并发现，循环DNA含量高于100ng/ml提示疾病的存在。之后，随着生物技术飞速发展，多种灵敏的DNA定量检测方法应运而生，包括：缺口平移法6、竞争PCR7、荧光检测法8，紫外分光光度法9和实时荧光定量PCR8等。技术的发展推动了循环DNA的研究（图1），大量文献表明，各种类型疾病患者血浆血清DNA存在量和性质的改变，这些变化具有很大的临床意义和诊断价值。 图1 Pubmed数据库搜索循环DNA相关文章，显示其数量不断增长 搜索词：(DNA/blood[MeSH] OR DNA/cerebrospinal fluid[MeSH] OR DNA/secretion[MeSH] OR DNA/urine[MeSH]) 一、肿瘤 循环DNA的临床应用价值在肿瘤方面研究最多，特别是对于缺乏可靠诊断方法的实体瘤。方便无创的样本取材使得循环DNA成为最具发展前景的检测对象。 循环DNA定量检测 1977年，Leon等4首次报道肿瘤患者循环DNA水平显著高于正常人，且与病人的预后及疗效有关。此后的大量研究都证实了这一点，并且显示了一定的临床意义（表1）。 1983年，Shapiro等10采用放射免疫法对良恶性胃肠道疾病患者血清DNA进行定量检测，发现恶性患者血清DNA含量（412 ng/ml）显著高于良性患者（118 ng/ml），虽然其水平与肿瘤大小及部位无关，但联合CEA检测，对于消化道肿瘤，特别是胰腺癌的诊断，具有很高的敏感性和特异性。1990年，Maebo11采用斑点杂交技术检测肺癌病人血浆DNA含量，结果显示，肺癌患者、良性肺疾病患者和正常人这三者之间存在显著差异，且可用于疗效监测，当联合血清CEA，检测敏感性达78%。1995年，FOURNIé等12以缺口平移标记技术发现肺癌患者血浆DNA含量显著高于正常对照，IV期肺癌患者血浆DNA含量显著高于其他分期患者。 虽然早期定量检测技术的敏感性较低，但多数结果显示了循环DNA含量在正常与肿瘤之间的差异，为后期的研究奠定了基础。 科技的迅猛发展为循环DNA定量研究提供了崭新的技术平台，1996年，Heid13研究报道了用于核酸定量检测的新技术——荧光定量PCR（Real time quantitative PCR）。二十一世纪，以实时荧光定量PCR为主要技术的DNA定量方法已被广泛应用。2002年，Thijssen 8等同时采用荧光定量法和实时荧光PCR技术定量测定结直肠癌伴肝转移患者血清血浆DNA水平，发现血清DNA含量升高与肿瘤转移有关，而根据血浆DNA水平可判断患者的预后。2003年，Sozzi等14以hTERT基因为标准衡量肺癌患者循环DNA水平，结果显示，肺癌患者血浆DNA平均含量（24.3ng/ml）高于正常对照（3.1ng/ml），ROC曲线下面积为0.94，能很好的区分肿瘤与正常。2004年，Allen 15和Gal16则针对人类β-globin基因分别确定前列腺癌和乳腺癌患者循环DNA含量，前者研究表明，循环DNA水平可作为良恶性前列腺疾病诊断的指标，以1000 GE/mL为cutoff值，诊断敏感性为85%，特异性为73%；而以血清DNA含量221 ng/ml为cutoff值，可作为乳腺癌患者预后指标。同年，对肺癌患者血浆DNA研究17显示血浆DNA定量检测可作为肺癌的筛查实验；Gautschi等的研究18表明非小细胞肺癌患者血浆DNA与临床分期及生存相关；Camps Herrero C等19采用分光光度法对非小细胞肺癌患者血清DNA定量检测的结果亦与临床分期有关。 然而，最近的研究结果不容乐观。2005年，分别对前列腺癌20、胸部恶性肿瘤21及乳腺癌患者22循环DNA的定量研究显示，标本的收集和处理、DNA提取及检测方法对于DNA定量结果影响很大，而且由于缺乏高敏感性和特异性，仅能作为辅助检测方法，却无临床诊断价值。 表1 肿瘤循环DNA定量研究结果 疾病类型 样本类型 检测方法 DNA含量(n