第六单元 感染性疾病的免疫学检测.pptVIP

注意事项 1.试剂及检测样品应充分混匀，及时更换加样吸头避免交叉污染。 2.实验中不能随意移动反应板，否则容易造成假阳性。 3.保证足够的反应时间、及时观察结果。 4.阳性结果用另一种方法如ELISA法复查。 临床意义 梅毒螺旋体感染后2周左右患者血清中即可出现特异性IgM抗体，4周左右即可检测出特异性IgG抗体，TPPA法为检测 特异性IgG抗体的较好方法之一，其阳性可以提示曾经或现 在感染梅毒，与TRUST法的检测结果综合分析对梅毒的诊断、分期及治疗效果评价具有重要价值。 实验讨论 梅毒血清学的联合应用对梅毒诊断有何意义？ 实验讨论 TRUST法检测非特异性抗体，是现症梅毒患者实验室诊断的重要指标，但初期或晚期梅毒病人抗体浓度较低可出现假阴性，抗体浓度过高时出现前带现象也可出现假阴性，而某些疾病如自身免疫性疾病则可出现假阳性。 TRUST检测的非特异性抗体在感染1-2周即可出现，如滴度≥1∶4，又具有典型的临床表现，则现症梅毒的可能性较大。 需注意TRUST检测结果阳性需谨慎对待，低滴度(≤1∶4)除可能为生物学造成的假阳性外，还有可能是发病初期或使用抗生素延长了阳性血清出现的潜伏期。 TRUST滴度与病情活动呈正相关，并且可作为判定复发或再感染指征,对于高滴度者(≥1∶8)应考虑为现症梅毒病人，并结合临床症状给予适当治疗。 实验讨论 ELISA检测梅毒抗体具有较高的敏感性，并可用全自动酶标仪进行批量初筛，但特异性稍差，有一定的假阳性率，采用ELISA两步法可在一定程度上提高检测结果的敏感性和可靠性。 TPPA法特异性及敏感性均较高，可作为ELISA法及TRUST法筛查的确证实验。但该方法操作复杂费时。 ELISA和TPPA两种方法检测的梅毒抗体均为特异性抗体，该抗体即使经治疗后也可终生阳性，因此不能作为评价治疗效果，复发或再感染的指标。 实验讨论 综合应用特异性抗体和非特异性抗体两种方法检测及滴度分析不仅能够提高梅毒感染检测的敏感性和特异性，同时能够进行疗效观察，对于早期发现，早期诊断，早期治疗梅毒患者以及有效控制梅毒流行具有重要意义。 实验五 人类巨细胞病毒抗体IgM检测 实验目的 通过ELISA捕获 法检测HCMV- IgM抗体的操作 掌握ELISA捕获 法检测HCMV- IgM的实验原理 及操作程序 熟悉方法的特点 及应用 实验原理 用抗人IgM（u链）包被微孔板，与待检血清反应，使血清中所有IgM（特异性与非特异性IgM）均被捕获，经洗涤除去IgG，加入HCMV抗原，与固相上捕获的特异性IgM结合，加入针对HCMV抗原的酶标抗体形成固相二抗-IgM-抗原酶标抗体复合物，在底物酶的作用下显色，根据吸光度判断是否存在HCMV特异性抗体IgM及抗体量。 实验试剂及器材 1.实验试剂 抗CVBIgM阳性对照、阴性对照、弱阳性对照、血清，抗人IgM（u链），稀释液，底物A、底物B，终止液。 2.实验器材 包被有CVB抗原的微孔板、微量移液器、微量加样器吸头、试管、恒温水浴箱 操作步骤 1.稀释待测样本 2.温育 3.洗涤 4.加抗原 5.洗涤同步骤3 6.加酶结合物 7.洗涤同步骤3 8.加酶底物/色原溶液 9.加终止液 10.酶标仪测定吸光度值 结果判断 采用反应底物的最大吸收波长即（450nm）处测定各孔吸光度值。以样本孔吸光度值（S）/阴性对照孔吸光度值（N）1.0时判定为阳性。 注意事项 1.实验中同时设置阴性、阳性、弱阳性、和空白对照。 2.洗涤要严格按照要求，彻底洗涤，防止假阳性，但不可冲洗过猛过急导致假阴性。 3.严格控制反应时间和显色时间。 实验讨论 1.捕获法的灵敏度和特异性均强于间接法,请分析原因? 捕获法是以抗人IgM 抗体(抗人μ链) 作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM 类抗体(特异的和非特异的) 即可被固相抗体捕获，而IgG则被洗去，再加入特异抗原可与固相上捕获的特异性IgM 抗体结合，而不与非特异性IgM结合，这样非特异性IgM及IgG均被除去，排除了非特异性IgM等干扰因素。 实验讨论 间接法易受RF因子及非特异性IgM 的影响。间接法测定时，血清中特异的IgG 与包被的特异性抗原结合，而后与RF反应造成假阳性。同时，特异性的IgG能与IgM 竞争结合特异性抗原而造成假阴性。 捕获法利用抗人IgMμ链直接从被检血清中捕获IgM ,再进行特异性结合，避免了RF等干扰物质的影响，具有更强的特异性。 实验讨论 请结合所学知识，分析酶联免疫技术中其他方法的优点及缺陷。 患者，男，49岁主诉“右上腹隐痛、腹胀隐痛8年，反复牙龈出血2年” 体格检查：巩膜黄染，腹壁静脉曲张，肝脏于肋下4横指可触及，质硬，压痛，腹水征阳性。CT示：肝左叶大，肝裂增宽。 实验