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PC12细胞培养 PC12细胞 是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，具神经内分泌细胞的一般特征，因其具可传代特点，广泛应用于神经生理和神经药理学研究。 1. PC12细胞有两种：未分化型和分化型。其中未分化型的PC12细胞贴壁能力强，传代时需要胰酶消化，形状不规则。分化型PC12细胞传代时不需要胰酶，直接可以吹下来，形状规则。这两种细胞没有很大的区别，但我在实验中发现，未分化型的PC12细胞对药物的敏感性较之分化型的要差一些。 2. 由于PC12细胞是一种肿瘤细胞，在传代次数较多后，它的形状和性状会发生改变。这些改变尤见于未分化型PC12细胞。主要是细胞形状变得更加不规则，对药物的敏感性愈加下降。因此，建议长期用PC12细胞作实验的战友最好严格控制细胞的传代次数。 3.在复苏细胞时动作一定要迅速，放入温水中1～2min后要马上加入培养液中，培养12～24小时后更换一次培养液，这样不仅可以把DMSO吸掉，而且可以将死亡的细胞也吸掉。细胞一天一看即可，经常动会有影响。注意过滤后血清的PH值，因为培养液过滤后PH值会有所改变。复苏后的换液时间取决于您复苏时是否洗涤离心细胞，去除了冻存液中的DMSO，如果没有去除DMSO，细胞培养过夜后就要彻底换液；如果复苏时洗涤离心过，可以待传代时再换液也可。（据我个人经验，还是复苏时去除DMSO，细胞的生长状态好一些） 4. 状态良好的细胞复苏后 4 h即可贴壁，开始增殖，大约2 d即可传代，接种48h应该到了对数增长期。 5. 每天观察一两次细胞我不认为会对细胞的生长造成不良影响，不过每次观察的时间不易过长。 6. 传代时我认为最好不要用胰蛋白酶，因为胰蛋白酶对细胞有破坏作用。我以前用胰蛋白酶消化传代过PC12, 结果传代后的细胞虽然贴壁，形态也好，但就是增殖缓慢，所以我现在都是用枪吸取培养液直接吹打，传代后细胞增殖迅速，2 d就长满了（因为长的太快，我只好降低血清浓度，用5%FBS） 7. 传代的时机最好选在细胞生长旺盛，占瓶底70%－80%时最好，如果细胞长的太满，细胞的状态会越来越差，最后大片死亡；这种细胞传代后生长也不好；而且长的太满后，细胞贴壁牢，难于吹起来，相反，70%－80%时细胞很容易吹起来。 8. 如果细胞贴壁太紧，不得不用胰蛋白酶消化，注意低浓度，段时间，多洗涤。我一般用0.025％的胰蛋白酶，在镜下观察细胞突起收缩，有零星的细胞漂起就中止，或用肉眼观察，瓶底呈现薄雾状的模糊感时就中止，中止一定要彻底，要用含血清的培养液多洗涤离心几次，确保去除剩余的胰蛋白酶，否则传代后的细胞难以生长。 9. 就培养器皿的选用，我推荐在60mm的培养皿中培养传代，第一，在皿里细胞生长的更快，我想可能是皿比瓶的气体交换更好吧；第二，传代时吹打更方便，不易污染。? 细胞培养基DMEM的配制（初学）细胞培养基是由合成培养和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、纤维素、碳水化合物、无机离子和其它辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、贴附因子等，这是合成培养基无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清（１0%）。【仪器、材料和试剂】1．仪器：蠕动泵1套，滤器，高压蒸汽灭菌锅，磁力搅拌器，pH计。2．材料：3000mL锥形瓶，250mL或500mL培养液瓶，0.22mm的微孔滤膜。3．试剂：双蒸水，小牛血清，合成培养基（DMEM），NaHCO3。【操作步骤】1．过滤器的准备和安装（1）清洗好过滤器，干燥（2）将一张0.22mm的微孔滤膜在DDW中浸泡后放入滤器，注意不要有气泡。（3）用布或报纸包装好，121℃ 30min进行高压蒸汽灭菌处理。（4）在超净台内安装好过滤装置，准备过滤。2．合成培养基的配制DMEM? ? 13.5gNaHCO3? ???3.7g? ?? ?HEPES? ?2.38gDDW溶解10M的NaOH调pH为7.5定容1L(1)将干粉型培养基DMED溶于300ml的三蒸水中，再用300ml水冲洗包装内面两次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。(2)加入NaHCO3 3.7g??HEPES? ?2.38g。磁力搅拌器搅拌。完全溶解即可，不易在空气中搅拌过长时间，大量的CO2融入会影响培养基的pH（3）正常情况下用10M的NaOH调pH为7.5。（4）过滤除菌。于超净台中滤器过滤。（5）滤前、滤后分别取10ml的培养基于15ml的离心管中，置37℃ 24h，检测是否无菌。（6）检测无污染后，2℃－8℃下避光保存。?（7）使用时加入加抗生