细胞显微注射---资料中心---生物在线.docVIP

受精卵原核显微注射 [实验目的] 1 了解受精卵显微注射的基本原理及动物转基因制作过程 2 掌握受精卵显微注射基本技术 [实验原理] 显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的 基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制,可达100kb；实验周期相对比较短。由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，因而是目前建立 转基因动物极为重要的方法。 [仪器、材料和试剂] （一）仪器和耗材： 1.PN-30拉针仪（Narishige） 2. OLYMPUS SZX7实体镜 3. EG-400磨针仪（Narishige） 4. MF-900 锻针仪（Narishige） 5. OLYMPUS IX71倒置显微镜 6. Narishige显微操作系统 7. JM-250电泳仪（大连捷迈） 8 眼科手术器械及显微手术器械（ROBOZ） 9. 毛细玻璃管G-100，GC-1（Narishige） 10.细胞培养箱（Heraeus）、超净工作台、塑料平皿等。（二）试剂 1.目的基因制备相关试剂 1.1 分子克隆相关试剂：TaqDNA聚合酶，DNA 连接酶，各种内切酶等 1.2受精卵制备相关试剂：孕马血清（PMSG），人绒毛膜促性腺激素（HCG），透明质酸酶等 1.3 转基因载体制备相关试剂 1.3.1 细菌培养基 （1）LB培养基（1L）： NaCl 10g， 酵母提取物5g，蛋白胨10g ，pH7.0 （2）2×YT培养基(1L)：NaCl 5g， 酵母提取物10g，蛋白胨16g 1.3. 2 质粒提取溶液配制 溶液Ⅰ：L-葡萄糖50mM，Tris-Cl(pH8.0) 25 mM，EDTA(pH8.0) 10mM，121.5℃ 溶液Ⅱ（100ml）：1N NaOH 20ul，10%SDS 10ml，水90ml现用现配。 溶液Ⅲ（100ml）：5mM乙酸甲60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml。 1.4．胚胎培养及注射缓冲液： 胚胎培养液M16(5.533g NaCl, 0.356g KCl, 0.252g CaCl2·2H2O, 0.162g KH2PO4, 0.293g MgSO4·7H2O, 2.101gNaHCO3, 2.610g Sodium lactate, 0.036g Sodium pyruvate, 1.00g Glucose, 4.00g BSA, 0.06g Penicillin G · potassium salt, 0.05g Streptomycin sulfate, 0.01g Phenol Red, 用三蒸水定容至1L)，也可以用商品化的M16培养基。 受精卵操作培养液M2 (5.533g NaCl, 0.356g KCl, 0.252g CaCl2·2H2O, 0.162g KH2PO4, 0.293g MgSO4·7H2O,0.349g NaHCO3, 4.969g HEPES, 2.610g Sodium lactate, 0.036g Sodium pyruvate, 1.00g Glucose, 4.00g BSA, 0.06g Penicillin G · potassium salt, 0.05g Streptomycin sulfate, 0.01g Phenol Red, 用三蒸水定容至1L) 注射缓冲液（5-10mM tris-HCl pH7.4，0.1-0.25 1.5 转基因鉴定相关试剂 （1）核酸提取组织裂解液：Tris·Cl (pH7.4) 25mM，EDTA 100mM，SDS 0.5%， protease K 100ug/ml. （3）PCR鉴定试剂：TaqDNA聚合酶，dNTP，引物等 [方法与步骤] （一）外源基因的制备及纯化 相对其他转基因方法来说，用于显微注射的载体构建简单，最典型的载体主要包括：载体在细菌中扩增的相关元件（复制原点，筛选抗性基因等）；真核表达相关元件（启动子、增强子、目的基因、Poly A等）（如下图） 为了增强目的基因表达，可在目的基因中引入内含子或者直接用含内含子的基因组序列。为了提高目的基因整合的几率，在注射前需用限制性内切酶将载体线性化并尽量去掉原核序列。另外，注射的用DNA的纯度要求比较高，不能有微小颗粒和提取过程中有害杂质，否则会对细胞造成毒害，一般要求用cscl梯度离心纯化。所用的TE的浓度比一般溶解DNA所的TE有所区别，该TE由 5－10mmol Tris(pH7.4)和