原创力文档②菌丝过滤法 适于：丝状（放线菌、霉菌） 原理：野生型基本培养基上发育成菌丝； 缺陷型孢子不萌发可通过滤膜，野 生型菌丝不能通过。 C-3 检出缺陷型 逐个检出法 影印检出法 夹层培养法 限量补给法 ① 逐个检出法 ② 影印检出法 ③ 夹层培养法 ④ 限量补给法 在含少量的（0.01%）蛋白胨的MM上培养, 大菌落为野生型 小菌落的为缺陷型。 C-4 鉴定缺陷型-----生长谱法 斜面菌种-----生理盐水洗下细胞------洗涤-----涂布（105个/皿） 纸片1:氨基酸混合液; 纸片2:维生素混合液; 纸片3: 核酸水解液; 纸片4: 酵母水解液 （2）.抗阻遏和抗反馈突变型筛选 原理：选择结构类似物抗性突变株 抗阻遏：调节基因突变-----阻遏蛋白失活-----不能与代谢产物的结构类似物结合-----阻遏蛋白不起阻遏作用（反应的第一个酶继续合成）-----终产物照样合成 抗反馈：变构酶基因突变-----变构酶不能与结构类似物结合（仍能与底物结合）-----终产物照样合成 （3). 抗性突变株 抗生素抗性----提高抗生素产量 条件抗性----由于环境不同，表型可“野生型”，也可突变型。 二.代谢工程育种 1、改变代谢途径 2、扩展代谢途径 3、构建新的代谢途径 三、体内基因重组育种 1.原生质体融合 原生质体制备 原生质体融合和再生 融合子的选择 2.杂交育种 类 型 示 例 特 性 活性增加倍数 潜在应用领域 抗 体 人源抗体 亲和性 400 生物制药 酶 天冬氨酸转氨酶 催化特异性 10，000 生物制药 β -内酰胺酶 抗生素抗性 32，000 抗生素 枯草杆菌蛋白酶E 耐热性 65℃耐热时间 17 200 工业酶 细胞因子 人类干扰素 抗病毒 285，000 基因治疗 肿瘤抑制因子P53 37℃半衰期 12 基因治疗 代谢途径 砷酸盐代谢途径 砷酸盐解毒 40 生物制药 汞代谢途径 汞解毒 12 生物制药 部分DNA Shuffling技术的研究成果 作业: 1、基因组，转座因子，营养缺陷型，完全培养基，基因重组，普遍性转导与局限性转导，原生质体融合 何谓质粒？试述质粒的特点 大肠杆菌四种菌株的特点及相互关系 转化、转导、接合的本质区别 用细菌培养物经紫外线照射后涂布在有 Str的培养基上，在有光条件下培养，结果没有筛选出str抗性菌株，为什么？ 利用紫外线诱变，设计一个实验方案用于筛选E.coli his-菌株。 * MAT位点为活性位点，HMR和HML位点则为沉默位点。酵母的性别取决于活性位点的基因序列。MAT位点的转换是不可逆的，而是单向的。性别转换的方向依赖于细胞的接合型：约有80-90%的转换是异性的，这与沉默位点的位置有关。如果将沉默位点的基因颠倒一下，则出现92%的同型转换。 （2）局限性转导---是指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象。 三.细菌的转化 1.几个概念 转化 感受态 感受态因子 自然转化 人工转化 2.转化过程 双链吸附------单链进入-----同源区配对整合---复制与分离-------形成1/2转化子 Hfr菌株中F因子的整合、断裂和转移 四.基因定位和基因组测序 1.中断杂交技术 Hfr的接合中断实验 接合的结果转性低，染色体基因重组率高 Hfr的中断杂交实验 “全基因组鸟枪法测序” 也称“霰弹法”，是将基因组ＤＮＡ打成小片段进行测序，然后再将这些小的片段拼接起来，重新组装成一个完整的基因组。它的最大优点是经济、快速、高效，但对高性能计算的方法和设备要求非常高。 2.基因连锁 3.遗传图谱 4.基因组测序 全基因组鸟枪法测序的主要步骤是 第一，建立高度随机、插入片段大小为 2kb左右的基因组文库。 第二，高效、大规模的末端测序。测序 总长度达6倍基因组。 第三，序列集合、按末端重叠连接成大片断。 第四，重叠群按合适顺序排队、填补缺口。 鸟枪法测序的缺点 随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加， 高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。 DNA测序方法 1、双脱氧核苷酸终止法 2、化学修饰法 核苷酸序列分析 （1）Sanger 双脱氧链终止法 例; CTGACTTCGACAA ddATP ddCTP ddTTP ddGTP DN
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