实验五 植物组织总糖和还原糖含量的测定.pptVIP

* 实验五 植物组织总糖和还原糖含量的测定（3,5-二硝基水杨酸法） * （1）掌握还原糖和总糖测定的基本原理； （2）学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。 一、实验目的 二、实验原理 还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。 利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定。 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法，其基本原理是用比色法对还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量。 二、实验原理 在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸（DNS）共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光值，查对标准曲线并计算，就可以分别求出样品中还原糖和总糖的含量。 NaOH 黄色 棕红色 加热 * 三、仪器和试剂 1、仪器： 电子天平、恒温水浴锅、分光光度计（722型）。 2、试剂： 2mg/mL葡萄糖标准液、蒸馏水、3,5-二硝基水杨酸、6mol/L盐酸、碘-碘化钾、6mol/L氢氧化钠 * 四、实验步骤 1、葡萄糖标准曲线的绘制 取6支试管，按表加入试剂。 以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，光吸收值（OD540）为纵坐标，绘制标准曲线。 管号 葡萄糖标准液/mL 蒸馏水/mL 葡萄糖浓度mg/mL 3,5-二硝基水杨酸/mL 蒸馏水/mL OD540 备注 1 0 1 0 2.0 摇匀后，沸水浴加热2min，流动水冷却 9.0 摇匀后。测OD540 0 空白对照 2 0.2 0.8 0.4 2.0 9.0 ？ ？ 3 0.4 0.6 0.8 2.0 9.0 ？ ？ 4 0.6 0.4 1.2 2.0 9.0 ？ ？ 5 0.8 0.2 1.6 2.0 9.0 ？ ？ 6 1 0 2 2.0 9.0 ？ ？ * 四、实验步骤 2、样品中还原糖的提取 （1）称取5g烟草叶片放入研钵中，加入5mL蒸馏水研磨成匀浆液。将匀浆液全部转移至锥形瓶里。 （2）再用10mL蒸馏水冲洗研钵，并将冲洗液全部转移至锥形瓶里。 （3）往锥形瓶里加入20mL蒸馏水，摇匀，于50℃保温20min，不时搅拌。 （4）用漏斗过滤，将滤液全部收集到烧杯中，最终用50mL容量瓶加蒸馏水定容至50mL，即为还原糖提取液。 * 四、实验步骤 3、样品中总糖的提取 （1）称取0.5g烟草叶片放入研钵中，加入5mL蒸馏水研磨成匀浆液。将匀浆液全部转移至锥形瓶里。 （2）再用10mL蒸馏水冲洗研钵，并将冲洗液全部转移至锥形瓶里。 （3）往锥形瓶里加入10mL 6mol/L盐酸，摇匀，于沸水浴中加热30min，不时搅拌。 （4）取出1-2滴置于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液检测水解是否完全。如水解完全，则不呈现蓝色。 * 四、实验步骤 3、样品中总糖的提取 （5）水解完毕后，用漏斗过滤，将滤液全部收集到烧杯中。冷却至室温后加入6mL 6mol/L氢氧化钠溶液。 （6）最终用100mL容量瓶加蒸馏水定容至100mL，即为总糖提取液。 * 四、实验步骤 4、样品中含糖量的测定 取5支试管，按表加入试剂。 管号 蒸馏水/mL 还原糖/mL 3,5-二硝基水杨酸/mL 于沸水浴中加热2min后，用流动水冷却 蒸馏水/mL 平均值 OD540 在标准曲线上得出提取液的浓度（mg/mL） 1 1 / 0 2.0 ？ 9.0 0 0 2 / 1 总糖/mL 2.0 9.0 ？ ？ 3 / 1 / 2.0 9.0 ？ 4 / / / 2.0 9.0 ？ ？ 5 / / / 2.0 9.0 ？ 1 1 ？