胰腺癌中miRNA基因序列变异的研究.docVIP

胰腺癌中miRNA基因序列变异的研究 朱政 (苏州大学附属第一医院腔镜病区江苏苏州215000 ) 【 】MicroRNAs (miRNA)是一类约20~22碱基大小的小分子非编码RNA° 是一类新发现的在转录后水平负性调控基因表达的基因调控因子。miRNA在多种 肿瘤中都存在表达异常。miRNA表达异常可能在胰腺癌的发生中起到了重要作用。 木课题假设miRNA的基因序列在胰腺癌中存在变异，因此检测了 8种miRNA在 胰腺癌组织及肿瘤细胞株中前体的基因序列。总共发现了 4种新的基因序列的变 异。miRNA定量分析显示，miR-21在20例胰腺癌病例标木及6种肿瘤细胞株中 均有显著的高表达。新发现的一个位于pre-miR-21基因下游29个碱基处的A-G 突变导致了其附近二级结构的改变，并引起miR-21的相对低表达。这些结果显 示miRNA可能在胰腺癌的发牛中起到了重要的作用，但是其基因序列的变异引 起表达异常的分子机制仍待进一步的研究。 【关键词】microRNA,胰腺癌，启动子，二级结构【中图分类号】R735.9【文献 标识码】B【文章编号】1007-8231 (2011) 12-2265-03 .、八.、■刖B 胰腺癌因为早期就会发生转移，病人就诊时往往己是晚期，并且对放 化疗不敏感，是一种非常致命的疾病，预后很差［匕2］。经过数十年的研究，人 们对胰腺癌发生的分子机制仍然所知甚少。因此，进一步研究与肿瘤的发生、发 展有关的基因有助于我们诊断及治疗这种疾病。 一类新发现的小分子非编码RNA—microRNA (miRNA),可能会给肿瘤 的研究带来新的认识。miRNA是一类20?22个碱基大小的小分子非编码RNA,在 转录后水平负性调控基因的表达。它们结合到目标mRNA的3rsquo;非编码区后, 通过分解mRNA或抑制其翻译来负性调控目标基因的表达。miRNA首先从基因 组DNA转录为一个大分了转录了 pri-miRNA,然后在细胞核内由Drosha酶加工 成发卡结构的pre-miRNAo Pre-miRNA接着被Exportin-5转运至细胞浆内，由Dicer 酶加工为成熟miRNA ［3-5］o 目前的研究显示，miRNA可以起到类似肿瘤抑制基因或癌基因的作用 ［3］。miRNA在肿瘤中所起的作用，主要与其异常的表达水平有关。在胰腺癌及 多种肿瘤中，miRNA的表达图谱已陆续有人报导 调控miRNA表达及成熟的确切机制尚不明确，但之前的研究提示了几种可能的 机制，包括遗传学和表观遗传学的变异［14,15］。miRNA的基因突变，可能会对 其转录、加工或是识别靶基因的过程产生影响［16］。本课题的目的是发现胰腺 癌中miRNA的基因突变，并研究其功能。 1材料及方法 1.1材料 共收集了 20例在2009年到2011年间在苏州大学附属第一医院接受手 术治疗的胰腺导管腺癌患者的病例标本。包括肿瘤组织及周围正常胰腺组织。这 些标本都是新鲜冻存，并经过病理学确诊的。同时收集了5例正常胰腺组织标本 及7例健康人外周学基因组DNA标本。培养了 6例肿瘤细胞株:BXPC?3、CFPACJ、 PANC-1 R SW1990 （胰腺癌细胞株）;MDA-MB-231 （乳腺癌细胞株）;HEPG2 （肝 癌细胞株）。使用 AxyPrepTM Multisource Genomic DNA miniprep 试剂盒提取 DNA, Trizol 提取 RNAo 1.2检测miRNA的基因突变 首先参考TcDNA基因芯片数据［11-13］, aCGH数据［17-21］以及其 他肿瘤的相关文献［6-10］,挑选出如下8种可能于胰腺癌有关的miRNA： miR-15a^ miR-16-1^ miR-21 miR-155 miR-196a-l miR-196a-2 miR-219 和 miR?375。使 用PCR扩增了每个pre-miRNA大约800 bp长度的基因组片段（包括上游约500 bp 及下游约200 bp）。此长度的基因组片段基本包括了 miRNA基因的所有功能区域 ［22］。PCR引物序列及反应条件见表1。所有标本均送上海英骏生物技术有限 公司测序。 1.3TaqMan 实吋定量 RT-PCR 采用实时定量RT-PCR检测miR-21的表达水平。首先使用TaqMan 2 x Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG 试剂盒合成 cDNA。再用 TaqMan miRNA assays试剂盒检测成熟miRNA表达水平。使用RNU6B作为内参。所有的 PCR 反应都在 Rotor-Gene 3000 real-time rotary analyzer PCR 仪进行。每个标本都 做双份反应体系。