包括Ti质粒转化载体-西北师范大学.PPT

第七章 植物基因工程 第一节、植物基因工程载体种类命名及规则 命名 第二节、根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能 7.2.1、Ti质粒的物理图及基因图 7.2.2、Ti质粒的生物学功能 7.2.3、T-DNA的基因结构与功能 7.2.4、T-DNA上的编码基因及功能 7.2.5、不同类型Ti质粒的特点 7.2.6、Vir区操纵子的基因结构与功能 第三节、农杆菌Ti质粒基因转化机理 第四节、农杆菌Ti质粒的改造及载体构建  第五节、载体构建中常用的选择标记基因及报告基因 选择标记基因的应用及原理 选择标记和报告基因的选择策略 常用的报告基因 T-DNA在植物染色体中的插入是随机的。可插入任何一条植物染色体，但插入位点常有以下点: ①T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点； ②T-DNA与植物DNA连接处富含A．T碱基对； ③植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。 在T－DNA的整合过程中还常发现植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复等现象。这说明T－DNA的整合依赖于植物内源重组系统。 （1）整合位点及其特性 7.3.2、T链整合植物基因组的分子机理 Mayerhofer等发现T－DNA的插入使得靶序列缺失29～73bp。 一部分整合的T-DNA片段不完整，两端均有缺失。靶序列断裂处与插入的T-DNA两端有部分重叠。 另一部分整合的T-DNA却保持完整。其中一些插入的T－DNA能精确地取代植物靶序列，其右边界与靶序列连接，T－DNA左末端和靶序列裂口同源。 还有一种情形则是，T-DNA插入片段的末端与缺失的靶序列裂口处并无同源性，而是在其内部有部分短片段与T-DNA末端同源。在靶序列裂口处还发现有DNA序列的倒位或重复。 为了解释所观察到的这些T-DNA整合情形，Mayerhofer等提出了“双链断裂修复模型”（DSBR）和“单链缺口修复模型”（SSGR model） （2）T-DNA的整合机制 DSBR:首先是植物靶DNA产生双链断裂，解旋的靶DNA与T-DNA退火；单链部分被核酸内切酶去除；然后进行修复连接，并导致缺失 SSGR ①在靶DNA上形成一个缺刻，然后由于部分解旋或酶消化形成缺口；②单链T-DNA靠近缺口，由于两链存在短的互补顺序，于是退火形成异质双链；③T链未配对的5’和3’单键部分被除去，T-DNA末端与靶DNA连接；④在靶DNA链的互补链产生缺刻，以游离的3’DNA末端为引物修复合成第二条T-DNA链。 修复与复制是T-DNA整合中的重要机理之一。因此T-DNA优先整合进植物染色体转录活跃区，反映了该区的各种拓扑结构如D环、缺刻、缺口、断裂等适合于 T-DNA的整合。 综上所述，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和TDNA间短的同源区段发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。 Mxsore等人（2000）的研究证明，组蛋白H2A和 T-DNA与植物基因组的整合有关。 已知 T-DNA可插入多个物理位点，T-DNA可几个拷贝连锁在一起，也可以分别插入不同位点。当多拷贝T-DNA进入同一植物细胞后，这些拷贝之间可能相互作用，导致基因的沉默，这种现象现被称为共抑制（co-suppression）。 （1）T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排，但多数插入会导致靶位点处小的缺失，缺失多至79个核苷酸。 （2）在T-DNA／植物DNA连接处，会有几个至33个核苷酸的“填充” DNA（filerDNA）存在，这些“填充”DNA的序列与靠近连接处的植物DNA序列相似。 （3）在植物靶位处不要求有特异的序列，但若在T-DNA两端和植物靶位处之间有一段短序列（5～10bp）同源，则利于整合。 （3）T-DNA整合的遗传效应 Chv同样参与细菌的附着。ChvA,B,C基因发生突变使根癌农杆菌与植物细胞的滩附率降低10倍。这三个基因与环状a-1，2-葡聚糖的合成和运输有关。ChvB基因产物催化合成葡聚糖；ChvA编码产物则与多糖从胞质转运到胞外有关， pscA位点与环化葡聚糖和琼山酸多聚糖的合成有关。 除上述基因外，还有一些染色体基因在T-DNA转移过程中起重要作用。目前巳知农杆菌染色体上有10个基因与T-DNA转移有关。 7.3.3、农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控 （1）目的基因克隆载体： （2）中间克隆载体：中间克隆载体是由大肠杆菌质粒插入T－DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成。它是构建中间表达载体的基础质粒。 （3）中间表达载体：中间表达载体是含有植物特异启动子的中间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。 （4）卸甲载体：卸甲载体是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，其功能是作为构建转化载体的受体质粒。 （5）植物基因转化载体：植物基因转化载体是最后用于目的基因