分子生物学及基因工程酶学基础.pptVIP

第六章 分子生物学与基因工程的酶学基础 第一节 限制性内切酶 6.1.4 限制性内切酶的命名方式 6.1.5 同尾酶和同裂酶 6.1.6 Ⅱ型酶的特点和识别位点 6.1.7 类型II限制性内切酶的主要用途 2，产生克隆位点 6.1.8 影响核醚内切限制酶活性的因素 6.1.8 影响核醚内切限制酶活性的因素 6.1.8 影响核醚内切限制酶活性的因素 6.1.8 影响核醚内切限制酶活性的因素 6.1.8 影响核醚内切限制酶活性的因素 6.1.9限制性内切酶对DNA的消化 6.2.1 连接酶 6.2.2 常见的DNA连接酶 6.2.3 连接酶的连接作用 6.2.4 DNA的连接策略 第三节 DNA聚合酶 6.3.5 Taq DNA聚合酶 (一)酶活性与热稳定性 (二)离子依赖性 (三)忠实性 (四)抑制剂 6.３.６　T7 DNA聚合酶 T7 DNA聚合酶有如下几个方面的用途： 修饰的 T7 DNA聚合酶 6.３.７　末端转移酶 返回第三章 （1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+ 连接条件 二、平末端DNA片段的连接 一、粘性末端DNA片段的连接 (1)同聚物加尾法 (2)衔接物连接法 双衔接物法 (3)DNA接头连接法 6.2.5．热稳定的DNA连接酶 从嗜热高温放线茵菌株中分离纯化 能够在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接作用的一种核酸酶:在85℃高温下都具有连接酶的活性，而且在重复多次升温到940 ℃之后也仍然保持活性。 使用此种DNA连接酶进行体外连接，可明显降低形成非持异性连接产物的机率。 现已经能够从克隆的大肠杆菌中大量制备. 两条位置彼此相邻的寡核苷酸探针，同一种与之互补的变性的靶DNA之间杂交，当它们同靶DNA链碱基完全配对时，便可被连接酶连接。 如果在其接合点或靠近接合点处存在着与靶DNA错配的碱基，它们之间就不可能形成磷酸二酯键。 由于一般情况下探针的标准长度是20-25个核苷酸，因此它们只能同基因组中的一个确定的部位作持异性杂交。 以此来检测靶DNA上探针相邻位置是否有碱基突变。 6.2.6 寡核苷酸连接测定 也叫连接扩增反应，是应用寡核苷酸探针通过DNA连接酶的作用扩增已知序列的靶DNA 6.2.7 连接酶链式反应 连接酶链式反应的应用：可以用人工合成的寡核苷酸探针合成较长双链DNA 2.2.8 连接策略 1、匹配的粘性末端： ２、平末端： ３、不匹配的粘性末端： 返回第三章 DNA聚合酶：需要模板，有多种活性，催化1个个核苷酸在链的3’接上去Taq DNA聚合酶 ： 来自于嗜热的古细菌逆转录酶：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成一段与mRNA互补的 DNA片段末端核苷酸转移酶：需要模板 有三种活性，即5’-3’的聚合酶活性、5’-3’的核酸外切酶活性和3’-5’的核酸外切酶活性。3’-5’的外切活性比T4或T7聚合酶的活性低得多。 6.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ) √ × √ √ √ √ 枯草杆菌蛋白酶水解大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶所得 K1enow聚合酶仍具有5’-3’的聚合酶活性、 3’-5’的核酸外切酶活性,但失去了全酶的5’-3’的核酸外切酶活性。 在DNA分子克隆中，Klenow聚合酶的主要用途有： (1)修补经限制酶消化的DNA所形成的3’隐蔽末端 (2)标记DNA片段的末端 (3)cDNA克隆中的第二链cDNA的合成 (4)DNA序列测定。 6.3.2 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ K1enow片段 从T4噬菌体感染的大肠杆菌中纯化。 由噬菌体基因43编码的. 具有两种酶催活性，即5’-3’ 聚合活性、 3’-5’ 外切活性 可以用来标记DNA平末端或隐蔽的3’ 末端。 在没有核苷三磷酸存在的条 件下， 只具有3’-5’ 外切活性. 6.3.3 T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA 6.3.4 反转录酶 最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒(AMV)的反转录酶，由两条多肽链组成. 其中一条肽链具有反转录酶活性和RNaseH活性。RNaseH活性是一种核酸外切酶，它以5’-3’ 或 3’-5’的方向特异地降解RNA—DNA杂交分子中的RNA链。 另一条肽链则具有以RNA—DNA杂交分子为底物的5’一3’脱氧核酸外切酶活性 是从一种水生栖热菌分离提取的。嗜热真菌能在70～75℃生长。该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离。 每个酶分子每秒钟可延伸约150bp，70℃延伸率大于60bp/秒，55℃时为24bp/秒。温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响酶的活性。 该酶虽然在9