实务专研题究报告指导老师张文兴老师学生陈婉平系级生农.doc

實 務 專 研 題 究 報 告 指導老師：張文興老師 學生：陳婉平 系級：生農四甲 學號：0951952 前言 Randomly amplified polymorphic DNA(RAPD)，是逢機放大多形性去氧核糖核酸分型法，是用一段大約10-15bp的引子，以隨機的方式與待分析的質體DNA進行PCR反應，藉由電泳圖片段進行指紋分析，用來區分個體間的差異。 RAPD常用來分析種與種之間的區別(亞種)，用已知的primer對血緣相近的品種作分析，利用種與種間微小片段的差異，來判別待分析質體DNA間的關係，RAPD比較像是針對有部份序列相同的基因來做探討，且可在較短的時間內得到結果(相較於PFLP的費時與費力)。 材料： 鴨血 (genomic DNA)、 Phusion (5xHF buffer,400μl;5xTE,540μl;Phusion DNA polymerase,10μl;dNTA,50μl) Mg2+ 、PCR機器、agarose Primer：EcoRⅠ-5：5’-(CGAATTCAACGCGCAAC)-3’ EcoRⅠ-6：5’-(CGAATTCCCCGTCAGCA)-3’ 方法 抽鴨血的genomic DNA 取鴨血10μl，加入500μl lysis buffer，65℃，10 min 降溫後，加2μl proteinase K，37℃，over night 原體積1/10的飽和NaCl，12000 rpm，10 min 取上清液，加兩倍isopropanol，-20℃，20 min 在4℃離心機，12000 rpm，10 min 去上清液，用75%EtOH 1000μl，wash2次 在12000 rpm，10 min，去上清液 DNA乾燥，用20μl TE回溶 PCR (鎂離子濃度的不同) 準備14個PCR用的tube，分成兩組(EcoRⅠ-5 EcoRⅠ-6) sample 1μl primer 0.5μl phusion 7.5μl 鎂離子 0.1.2….6μl (分成7種濃度) TE 6.5.4….0μl (分成7種濃度) 總體積 15μl 2-1. hot start，98℃，30秒 2-2.denature，98℃，10秒 2-3.anealing，36℃，15秒 2-4.extention，72℃，30秒 2-5.final extention，72℃，10分鐘 2-6.cool down，4℃，∞ (2-2~2-4，重複40個循環) 電泳，電極由負到正，100V 用EtBr染色數秒，用清水清洗，並退染數十分鐘 照膠片紫外光照相系統 結果 左圖：由左至右，primer是EcoRⅠ-5，第一個為marker，依序鎂離子濃度由0μl遞增到6μl，TE由6μl遞減為0μl 右圖：由左至右，primer是EcoRⅠ-6，第一個為marker，依序鎂離子濃度由0μl遞增到6μl，TE由6μl遞減為0μl 討論： 可看出EcoRⅠ-5的DNA小片段較為明顯，DNA的含量較多；且在鎂離子濃度為5μl，TE濃度為1μl時，表現達到最大量。 先前的實驗在做到溫度梯度的分析時，即失敗了。推測可能是溫度的設定錯誤，而且DNA的濃度不夠純，須將DNA再純化，再做溫度梯度的分析。之後做溫度梯度時，可將溫度提高至36℃~50℃，以提高專一性；使用EcoRⅠ-5當primer有較好的效果，並取鎂離子的濃度為5μl，TE濃度為1μl，希望可以得到較理想的結果。