原创力文档- 1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
华中科技大学同济医学院 硕士学位论文
材料和方法
1．试验材料
1．1细胞来源
MKN-28细胞株为人类胃癌细胞，由本实验室传代培养。
1．2标本收集
手术切除标本(腺癌，胃癌6例，结肠癌5例，直肠癌9例)，每例包括癌组织、癌
旁黏膜(距癌边缘5cm以内)、正常组织黏膜(切除标本的远端边缘组织)三种组
织。
1．3主要试剂
(1)DMEM培养液
(2)胎牛血清(Gibco公司)
(3)胰蛋白酶
士惠赠)
Biosciences公司)
(5)鼠抗Rb单克隆抗体(购自BD
(6)蛋白A(ProteinA-Sepharose，购自Pharmacia)
(7)蛋白分子量标准(Marker,购白Fermentas)
1．4仪器与器材
低温高速离心机
台式离心机
超净工作台
恒温C02细胞培养箱
细胞记数板
匀浆器
恒温水浴箱
一70℃低温冰箱
华中科技大学同济医学院 硕士学位论文
全套聚丙烯酰胺凝胶电泳装置(Bio．Rad公司)
室温摇床 ．
2．实验方法
2．1试剂的配制
1mM
(1)蛋白酶抑制剂： PMSF，1ug／mlAprotinin，1ug／mlLeupeptin，1ug／ml
Pepstnin，用乙醇配制，放入一20。C冰箱保存。
RIPA 称取氯化钠1．169克，
(2)组织裂解液LysisBuffer(modifiedbuffer)=
Tris—base0．242克，TritonX一1002ml，EDTA0．074克，十二烷基磺酸钠(SDS)
放入4℃冰箱保存，l临用前加入蛋白酶抑制剂。
SDS
4克，甘油20ml，
(3)2xSDS加样缓冲液：4xTris-CI／SDS(PH6．8)25ml，
加双蒸水至100ml。
酶抑制剂1ul，加双蒸水至100ul，临用前配制。
(5)PH8．8的Tris-CI：称取Tris-base45．412克，0．4％SDS1克，调PH值8．8，
加入双蒸水至250ml。4。C保存。
(6)12％分离胶缓冲液：30％丙烯酰胺3ml，4xTris·CI／SDS(PH8．8)1．875m，双蒸
0．005ml。
水2．625ml，10％过硫酸铵0．025ml，TEMED
6．055克，0．4％SDS
(7)PH6．8的Tris—CI：称取Tris．base 0．4克，调PH值6．8，
加入双蒸水至100ml。4。C保存。
(8)积层胶缓冲液：300／0丙烯酰胺0．65ml，4xTris·CI／SDS(PH6．8)1．25ml，双蒸
0．005ml。
水3．05ml，100／0过硫酸铵0．025ml，TEMED
称取Tris．base
(9)5×电泳缓冲液： 15．1克，甘氨酸72克，SDS5克，加入双蒸
水至1000ml。室温保存。
Iris—base3．034克，甘氨酸14．416克，甲醇200ml，加
(10)转膜缓冲液：
双蒸水至1000ml，4℃冰箱保存。
NaCI
15ml，Tween．20
(11)洗膜缓冲液(TBST)：2MTris—base(PH7．5)5ml，5M
文档评论（0）