大血管等绒毛尿囊膜接种法.ppt

医学微生物学实验 内 容 提 要 一 抗酸染色 二 病毒的接种技术 三 真菌菌落的观察 （小白鼠和鸡胚共用注射器16支，病毒悬液用锥蓝染液代替，小白鼠8只，鸡胚15只，微量移液器4支，真菌示教培养管4支） 病毒的培养真菌菌落形态观察 1 病毒的动物接种 目的 了解病毒的动物接种法 材料 小白鼠（1~3天或3周龄）， 乙型脑炎病毒悬液， 1ml注射器（8支），碘酒 ，棉签，眼科剪等 接种3~4天后小白鼠出现耸毛，活动减少或增强，表现出如震颤，绕圈，蜷曲，尾强直或麻痹，直至瘫痪死亡。一般在濒死前解剖去脑组织传代及做病毒鉴定。 （本次实验不做饲养，接种完成可立即处死小白鼠，剪开头部皮肤，打开颅腔观察锥蓝染液的分布，确定穿刺接种是否正确） 2 病毒的鸡胚培养法 目的 了解病毒的鸡胚培养法 材料 9~12日龄鸡胚，病毒悬液，无菌1ml注射器，锯片，锥子，小镊子，橡皮头，小烧杯等 本次实验不做培养，接种完病毒，可将鸡胚去除部分卵壳后，小心将卵壳内组织倒入平皿中，观察接种的病毒替代液（锥蓝染液）是否接种部位正确及各膜囊等的组织结构。 实验报告 抗酸染色 简述抗酸染色原理、方法和结果。 绘制抗酸染色油镜下观察图。 4 接种：去除卵膜，用注射器抽取病毒悬液0.2ml,于绒毛尿囊膜上滴上病毒悬液0.1~0.2ml。 5 封口：用胶布封闭两口，胶布事先用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘。 6 培养：放入37℃温箱培育4天 7 收获：在人工气室周围用碘酒消毒，用无菌镊子扩大卵窗，轻轻夹起绒毛尿囊膜，并用无菌小剪刀沿人工气室周围将绒毛尿囊膜剪下，放置于加有生理盐水的无菌平皿中观察。 注意事项 消毒小白鼠时不要碰到眼睛 注射时不要扎的太深以免扎到手 磨卵壳及钻孔时力量要适中 看过的鸡胚不要倒入水池，倒入指定的大烧杯中 真菌菌落的观察（示教） 真菌培养营养要求不高，在一般培养基上能生长 常用沙保弱（Sabouraud）培养基（含4%葡萄糖、10%蛋白胨、琼脂、pH4.0~6.0），真菌的最适酸碱度是pH4.0~6.0，最适生长温度浅部真菌22~28℃，深部真菌37℃ 。 真菌菌落类型 酵母型菌落（yeast colony） 菌落光滑、湿润；无菌丝 隐球菌菌落 类酵母型菌落（yeast-like colony） 外观和酵母型菌落相似，显微镜下可看到假菌丝 白色念株菌菌落 丝状型菌落（filamentous colony） 菌落系由多细胞菌丝体所组成 大多数丝状真菌或霉菌的菌落 新型隐球菌：菌落属酵母型菌落，圆形、较大、白色、边缘整齐，表面湿润光滑，与一般细菌菌落相似 . 白色念珠菌：菌落属类酵母样菌落，圆形、较大、白色、菌落底层有假菌丝长入培养基内. 表皮癣菌：菌落属丝状菌落，在沙保琼脂斜面培养基上菌落开始为白色，颗粒状，以后变为绒毛样甚至粉末状，有许多辐射状沟，呈草绿色，且培养基常有皱裂。 小孢子菌：菌落属丝状菌落，在沙保培养基上菌落为棉絮状、羊毛状或粉末状。 * * 新乡医学院微生物学教研室 监督电话:3029945 Email:jcbwsw@xxmu.edu.cn 一、实验目的 　1、掌握分枝杆菌抗酸染色的操作方法和意义 　2、熟悉抗酸染色的原理。 　抗 酸 染 色 Acid fast stain 分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。 齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用3%盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。 二、实验原理 细菌：卡介苗 （Bacillus Calmette-Guerin， BCG） 染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精、碱性美 兰溶液 其它：接种环、酒精灯、载玻片，玻片夹等 　　 三、实验材料 1、细菌涂片的制备 涂片 干燥 固定 2、染色 1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3 滴，在火焰高处（2~10cm）徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，加热3~5min，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，待标本冷却后用水冲洗。 2）脱色： 3%盐酸酒精脱色30s～1min；用水冲洗。 3）复染：用碱性美兰溶液复染1min；用水冲洗后用吸水纸吸干。 四、方法与步骤（与革兰染色的差别）