核医学-体外分析8年制.ppt

体外分析技术 体外分析技术 利用放射分析或非放射分析技术测定生物样品中微量生物活性物质含量的一类分析法。 体外放射分析技术 放射性竞争结合分析:放射免疫分析（RIA) 放射性非竞争结合分析:免疫放射分析（IRMA) 受体放射配基结合分析(RBA) 体外非放射分析技术 化学发光分析 时间分辨荧光分析 酶免疫分析 放射免疫分析（Radioimmunoassay,RIA） 概念 是利用特异抗体与标记抗原和非标记抗原的竞争结合反应，通过测定复合物放射性来计算非标记抗原的量的一种超微量分析技术。 1959年Berson和Yalow 首先报导人体血浆内源性胰岛素的免疫分析。 1977年荣获诺贝尔奖。 原 理 基本原理是竞争结合反应 *Ag+Ab *AgAb+*Ag (free) + Ag AgAb + Ag (free) *Ag和Ag与Ab具有相同的结合能力，当Ab的量有限时，相互竞争，相互抑制。 Ag和*Ag与Ab结合的量取决于两者的浓度比。遵循质量作用定律。 *Ag与Ab的结合率随着Ag的量的增加而减少，呈负相关。反之亦然。 原理 将结合型B (Ag?Ab和*Ag?Ab)与游离型F (Ag和*Ag)分离开，分别测定其放射性，则B/F与Ka和待测Ag呈函数关系。 用已知的不同浓度的标准Ag与一定量的*Ag和Ab作用，即可测得在各种标准浓度下的B/F比值，以此绘成标准曲线。 根据被测Ag的B/F比值，就可在标准曲线上求出相应的该抗原的含量。 原理 Ag+Ab AgAb 反应达到平衡时 Ka= = K1为Ag与Ab结合速率常数 K2为Ag与Ab解离速率常数 Ka为平衡常数或亲和力常数 K1 K2 K1 K2 [Ag?Ab] [Ag][Ab] 数学模式 数学模式 若Ag0及Ab0分别代表抗原及抗体的初始浓度，则平衡时： [Ag]=[Ag0]-[Ag?Ab] [Ab]=[Ab0]-[Ag?Ab] B/F= [Ag?Ab]/[Ag] (B/F)2+(1+Ka[Ag0]-Ka[Ab0])B/F-Ka[Ag0]=0 Ka为常数， [Ab0]为固定值， Ag0=*Ag+Ag， *Ag为设定的量。 B/F与未标记Ag之间呈函数关系。 基本方法:主要试剂 特异抗体 高亲和力(affinity): Ag与Ab结合的能力。 高特异性(specificity): 不易发生交叉反应。 高滴度(titer):所需抗体量少,杂质干扰少。 标记抗原 1)与待测物同一物质; 2)生物活性不变; 3)核素半衰期长; 4)高比活度、放化纯度。 标准品（非标记抗原） 常用液相分离技术: 收集抗原抗体复合物（B） 双抗体沉淀法: 分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价高，但 成本高. 聚乙二醇(PEG)沉淀法: 快速，价廉，来源方便，受环境影响大 葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法 常用液相分离技术： 收集游离抗原(F) 活性炭吸附法: 吸附游离部分，适用于分离小分子游离抗原。 快速、简便、准确性差. 葡聚糖包被活性炭(DCC) 增强吸附和减少解离，常使用。 活性炭联结氧化铁制备DCC. 常用液相分离技术: 固相法 固相分离法 按材料（塑料、纤维素、凝胶颗粒）不同，有试管法、微粒法等。 固相分离法是RIA近年来发展较快的领域 试管固相法：抗体吸附在塑料试管上 吸附量小，重现性差等 微粒法和微球法：吸附量大等。 基本步骤 加样：系列反应管中加入相同剂量的* Ag、Ab，不同剂量标准Ag或一定量样品。 孵育：反应达到平衡所需孵育时间温度不同。 分离结合及游离部分： 测放射性：125I、3H 数据