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* 体内成瘤能力检测 常用实验动物：裸鼠(nude mice) 裸鼠是1966年以来发现和培育的一种小鼠突变系，先天无毛、无胸腺、T淋巴细胞功能缺乏，对异种移植不产生排斥反应，因此适用于异种动物组织的移植和人类肿瘤异种移植。 * T、B淋巴细胞联合免疫缺陷动物 外观与正常小鼠无异，生长发育正常，但胸腺、脾、淋巴结的重量为正常的30% 对于人类肿瘤的移植成活率高达36.9％，而一般裸鼠为16.9％。 体内成瘤能力检测 常用实验动物：SCID （severe combined immunodeficiency disease, SCID）小鼠 * 体内成瘤能力检测 皮下接种(subcutaneous, s.c.) 　 在动物皮下接种新鲜肿瘤组织或肿瘤细胞系。 原位移植(orthotopic transplantation ) 　 将适量的肿瘤细胞接种于动物相应的器官组织。 * 细胞凋亡检测 细胞核形态检测：DAPI、PI、Hochest 细胞凋亡的特性： 染色质凝聚 染色质片段化 核皱缩 出现凋亡小体 * 细胞凋亡检测-Annexin V / PI 染色 正常状态下：PS位于脂膜的内层 早期凋亡：脂膜翻转，PS位于外层脂膜 凋亡后期以及细胞坏死：膜通透性增强 * TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling): 基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素(FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。 细胞凋亡检测-TUNEL检测 * 细胞凋亡检测 标记性分子检测细胞色素C的释放、Caspase-3/7的切割活化 * 肿瘤转移研究的常用方法 1、肿瘤细胞体外迁移实验 2、肿瘤细胞体外侵袭实验 3、体内肿瘤转移模型 * 肿瘤细胞体外迁移实验-划痕法 借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，测定肿瘤细胞的爬行运动能力。 对照组 实验组 * 对照组 实验组 肿瘤细胞体外迁移实验－ Transwell 小室法 体外培养的肿瘤细胞在趋化物质（如血清）作用下可以穿过多孔膜，穿膜细胞经过染料染色，以便于在镜下计数。 * 将matrigel铺在Transwell 侵袭小室的多孔滤膜上，能形成与天然基底膜极为相似的结构。具侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下可穿过多孔滤膜及matrigel ，侵袭细胞经染色后，在显微镜下观察和计数。 肿瘤细胞体外侵袭实验- Transwell 小室法 * 肿瘤细胞体外侵袭实验－－明胶酶活性法 体外培养的癌细胞能分泌明胶酶MMP-2，MMP-9 。细胞培养上清进行SDS检测，根据显色条带面积和亮度判定明胶酶活性。 * 体内肿瘤转移模型 皮下接种(subcutaneous, s.c.) 　 在动物皮下接种新鲜肿瘤组织或肿瘤细胞系。 原位移植(orthotopic transplantation ) 　 将适量的肿瘤细胞接种于动物相应的器官组织。 静脉注射(intravenous injection, i.v.) 　 取新鲜肿瘤标本或肿瘤细胞系，制备成单细胞悬液，从小鼠尾静脉、眼球后静脉丛或门静脉注入适量细胞悬液，诱发转移灶。 * 肿瘤血管生成的研究方法 体外实验模型 体内实验模型 * 1) 增殖、凋亡： 增殖: Brdu incorporation、flow cytometry 凋亡: TUNEL, active caspases 2) 迁移： Wound healing assay: 模拟体内伤痕修复过程中细胞迁移的情况 Transwell assay：检测细胞在趋化剂诱导下穿过多孔滤膜的情况 * 3) 管状结构形成 当内皮细胞于Matrigel上培养，可以通过增殖、迁移相互接触，连接成毛细血管样的结构； 通过检测形成的毛细血管的数目、长度、节点数等可以表征体外培养的细胞血管生成的能力 * HUVEC cells：人脐静脉血管内皮细胞 培养板培养 基质胶培养 * 1） Matrigel plug assay 当混合了促血管生成因子或肿瘤细胞的Matrigel注射到小鼠皮下，很快凝结成固体，可趋化小鼠本身的内皮细胞迁移、侵袭，在Matrigel中形成新生血管，且Matrigel类似基底膜的特性可以作为新生血管的支架。 体内实验模型 * 低倍镜 高倍镜 Matrigel plug assay * 2