《分子生物学常用技术在中医药研究中的应用》实验课 08 Northern blot(23P).pptVIP

* * 实验 19 Northern blot 目 的 1．定量分析某一特定基因mRNA的转录与否，以及转录的水平。 2．比较两个或两个以上不同组织某一已知基因转录的差异。 3．比较两个或两个以上不同组织某一未知基因转录的差异。 由于此方法具有稳定、可靠、假阳性少等特点，多年来一直深受广大研究者的喜爱。其结果可以同时反映某一特定基因RNA分子量的大小及其数量。在中医药实验中通常以此来判别某一中医药方法对某一已知基因转录的调控作用。例如我们的GnRH、N-ras、白蛋白等研究。 通常观察某一分子的变化有两个层次，蛋白水平的和核酸水平的。两者的含量变化均与其生成、代谢有关，而两者的作用发挥还关系到其质量、修饰、环境条件等因素，这些变化采用观察蛋白与核酸的量是不能回答的，所以对Northern blot的结果要有客观的分析。 类似的实验主要为RT-PCR。 原 理 采用变性凝胶电泳，使RNA分子由小到大排列于凝胶之中。应用虹吸原理，将RNA转移至硝酸纤维素膜，烘干，使RNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与放射性标记的探针杂交，杂交后，洗去未被杂交上的探针和游离的同位素，将硝酸纤维素膜放射自显影，使胶片上出现对应于相应分子量mRNA的条带。最后，对条带进行光密度扫描，并统计分析。 实验准备 （参考教材） 实验步骤 1．RNA电泳 取10ug RNA旋转真空干燥，溶于20ul新配的样品缓冲液。置样品于65℃水浴中5分钟，迅速移入冰中冷却，再加4ul上样缓冲液，混匀。移胶至电泳槽内，注入电泳缓冲液1×MOPS，浸没凝胶，轻轻拔去疏子。接通电源，负极靠近上样孔。吸取样品24ul，注入上样孔内。开启电源，电压调至100V。电泳约2小时，至溴酚蓝移至前缘时，关闭电源。 轻轻取出凝胶，移至紫外透射反射分析仪上检查电泳结果。在凝胶一侧放把尺，拍照。 2．RNA转移至硝酸纤维素膜 取一洁净的容器，注入20×SSC，容器上缘架一水平玻璃板。取2～4层滤纸，纸宽同凝胶长，纸长足以经玻璃板两侧浸入20×SSC中。待滤纸全都湿透后，滚动移液管赶走滤纸间及其与玻璃板间的气泡。切去凝胶上样孔及以上部分，在凝胶第一上样孔处切去一小角，作为记号，把凝胶底朝上放于滤纸上，用移液管赶走凝胶与滤纸间的气泡。把硝酸纤维素膜裁成凝胶大小，对应凝胶剪去一小角，先浸湿于双蒸水中，再浸于20×SSC中，取出平放于凝胶之上，缺角处与凝胶缺角处对齐。用移液管赶走凝胶与硝酸纤维素膜间的气泡。膜上置2～4层20×SSC浸湿的滤纸，用移液管赶走滤纸与硝酸纤维素膜间的气泡。 用4张保鲜膜沿凝胶4侧盖住凝胶旁的滤纸、玻璃和容器，以防止凝胶外形成虹吸短路，以及容器内的缓冲液干燥。在胶上滤纸之上方，铺4～6厘米厚的卫生纸，上置一平玻板，玻板上压一300～500克的重物。过夜。 次日上午，取出凝胶与硝酸纤维素膜，在透射紫外灯仪上确认RNA已全部转移至硝酸纤维素膜上。把该膜夹于两张洁净的滤纸间，在80℃真空干燥箱中真空干燥两小时。 3．探针标记（此工作与膜转移于同一天进行） 水 14 ul OLB 5 ul BSA （ 10mg/ml ） 1 ul DNA （ 30～50 ng ） 2 ul 100℃×5min, 37℃×10min, 4℃×5min α[32P]dCTP （50uCi） 2.5 ul 大肠杆菌聚合酶K片段 0.5 ul 混匀，4℃ 过夜，次日再加： 大肠杆菌聚合酶K片段 0.5 ul 半小时后加入终止液 50 ul 4．离心柱分离探针 （1）柱的制备 取消毒过的蓝吸头，用小玻璃珠或玻璃纤维放入吸头，堵住出口，将混匀的Sephadex G50（中号）移入吸头至满。取1.5ml Eppendorf管，剪去盖，放入10ml离心管中。将蓝吸头插入Eppendorf管，可自制一套圈或用一垫圈套于蓝吸头前部，以保证吸头尖距1.5ml管底部约1～2厘米。1600×g离心4分钟，弃去1.5ml管中的TE液，再用100ul TE液加入小柱，离心，如此反复两次平衡柱子。 （2）分离 用镊子取出原1.5ml管，取一新的1.5ml管放入10ml离心管，插上平衡过的小柱。将标记的探针液，加入小柱，1600×g离心4分钟，小心取出1.5ml管，将分离的到的探针移入一标签过的1.5ml管，盖紧盖子。 5．探针变性 将含探针的1.5ml管置于沸水中5分钟变性，迅速移入冰中冷却。 6．杂交 将硝酸纤维素膜在2×SSC中浸湿，以防碎裂，然后放入杂交袋中，四周封口，剪去一角注入10毫升预杂交液，