白细胞抗原系统检测.pptxVIP

第四章 白细胞抗原检测 严力行 目 录 第一节 HLA血清学检测 HLA抗原检测 HLA抗体检测 第二节 HLA细胞学检测 第三节 HLA分子生物学检测 HLA的分子生物学检测方法 HLA常见基因分型方法比较 HLA分型模棱两可结果的原因及其对策 第四节 粒细胞抗原抗体检测 第一节 HLA血清学检测 重点提示 HLA抗原检测 掌握微量淋巴细胞毒实验的原理及其影响因素 HLA抗体检测方法 淋巴细胞毒方法 流式细胞仪方法 ELISA方法 Luminex检测技术 掌握不同方法的原理及其优缺点 微量淋巴细胞毒试验 HLA抗原的血清学分型方法 用一系列已知的抗HLA标准分型血清来检测未知淋巴细胞表面的HLA抗原型别 微量淋巴细胞毒实验原理 基于抗原抗体反应 抗原抗体免疫复合物在补体的作用破坏细胞膜 利用染料或其它方法鉴定和区分死活细胞 计分法：NIH计分法 HLA抗血清的来源 HLA抗体血清来源 同种免疫刺激产生HLA同种抗体 HLA抗原免疫刺激动物 杂交瘤技术 人群存在的天然抗体 微量淋巴细胞毒试验的影响因素 HLA抗血清 抗血清来源和抗体种类、抗血清效价、抗血清特性、抗血清质量 淋巴细胞 淋巴细胞活性 、淋巴细胞纯度、淋巴细胞数量、淋巴细胞上抗原表达异常 孵育时间和温度 补体活性 染色和固定时间 血清学抗原分型方法评价 血清学方法抗原分型 检测HLA-Ⅰ类和Ⅱ类抗原 检测HLA-Ⅰ类抗原相对容易 检测HLA-Ⅱ类抗原需要分离和纯化Ｂ淋巴细胞 易受多种因素影响 其错误率相对较高 HLA血清学某一座位上只能检测到一个抗原，而基因分型存在两个不同等位基因，应考虑到无效等位基因 HLA抗体检测 补体依赖的淋巴细胞毒方法（CDC） 采用淋巴细胞作为靶细胞抗原 易受多种因素影响，检测敏感性最低 ELISA 方法 ELISA方法能检测HLA-I和HLA-II抗体 流式细胞术 采用淋巴细胞作为靶细胞抗原 结合荧光检测技术特点 Luminex检测技术 结合荧光流式细胞仪和免疫标记技术 可区分HLA-I和HLA-II抗体 可鉴定抗体的属性和强度 HLA抗体检测 Luminex检测技术 以包被抗原的微球磁珠作为靶细胞 每种磁珠上包被一种抗原 多种磁珠可以在同一体系内反应 待测血清与磁珠孵育 存在HLA抗体时，形成抗原-抗体复合物 加入荧光标记的抗人IgG抗体 形成抗原-抗体-荧光标记抗体复合物 Luminex仪测定微球磁珠上的荧光值 判定HLA抗体的强度和特异性 微球磁珠荧光值大小 每种磁珠的反应特性 第二节 HLA细胞学检测 重点提示 掌握下列方法的基本原理及其应用 混合细胞培养方法（mixed lymphocyte culture，MLC） 纯合分型细胞（homozygote typing cell,HTC） 预致敏淋巴细胞试验（primed lymphocyte test,PLT） 混合淋巴细胞培养 混合淋巴细胞培养（MLC） 二个无关个体的淋巴细胞在体外混合一起培养 二者组织相容性抗原不同，互相刺激对方的T细胞发生增殖 增殖反应强度与组织相容性抗原的差异程度成正比 转化的淋巴母细胞表现为细胞体积增大、核内DNA和RNA合成增加 MLC 用于HLA-D抗原分型 实体器官移植前的快速相容性检测 分为双向MLC和单向MLC 混合淋巴细胞培养 双向MLC 双方的淋巴细胞互相刺激而增生、转化，即双方的淋巴细胞既是刺激细胞，又是反应细胞 抗原相同或相容，则刺激作用很小，细胞无变化 抗原不相容，则刺激作用大，细胞被活化并产生增殖 单向MLC 一方的淋巴细胞用X线照射或用丝裂霉素C处理 丧失增殖反应能力而仍保留其抗原刺激效应 MLC只有一方淋巴细胞发生增殖反应，故可了解单一个体淋巴细胞的刺激强度和应答程度 纯合细胞分型方法 纯合细胞分型方法（也称为阴性分型） 已知HLA-Dw型别的经灭活的纯合子细胞作为刺激细胞 待检细胞作为反应细胞 两种细胞进行单向混合淋巴细胞培养 若不发生或仅发生弱的增殖反应 表明受检细胞具有与纯合子分型细胞相同的HLA-Dw型别，它可能为特定HLA-Dw型的纯合子或杂合子 发生增殖反应 表明受检细胞不具有纯合子细胞拥有的HLA-Dw型别 预致敏淋巴细胞（PL） 预致敏淋巴细胞（PL） 仅对一种单体型具有识别增殖能力，而处于静止状态的小淋巴细胞 作为应答细胞参与了初次MLC反应，经过增殖后又回到小淋巴细胞 遇到相应抗原刺激后，迅速发生淋巴细胞转化和增殖 预致敏淋巴细胞试验 预致敏淋巴细胞试验（又称为阳性分型法) PL细胞作为已知的分型细胞 待检淋巴细胞作为刺激细胞 待检淋巴细胞分别与一系列的预致敏淋巴细胞进行单向MLC 待检细胞与预致敏淋巴细胞预先识别的抗原相同，预致敏淋巴细胞会迅速增殖 预致敏淋巴细胞分型试验是用阳