蛋白表达技术.pptVIP

甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。 甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长，培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。 利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。 近年来，用该表达系统成功表达的蛋白达到了300多种，表达的蛋白主要包括基因工程疫苗，如乙肝疫苗及一些来自动植物和细菌的各种酶、膜受体蛋白、抗原和抗体及一些用来研究晶体结构的蛋白等。同时，该系统作为一种基础研究的模型系统在分子生物学领域也发挥了越来越重要的作用，如用该系统进行过氧化物酶体的输入和组装及真核细胞的分泌途径和功能等方面的研究。目前国内也有多种蛋白在该系统中获得了高效表达，如人白蛋白、人胰岛素、干扰素、乙肝表面抗原、集落刺激因子等几十种蛋白质。 昆虫细胞表达系统是目前国内外很推崇的真核表达系统。依托杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子而构建的表达载体，有效甚至高水平地使很多真核目的基因得到表达。 利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。 优越性： ①重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配； ②可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体； ③可进行分泌表达。 缺点： ①糖基化与哺乳动物有所差别； ②表达量有限； ③作为药物宿主细胞未被FDA认可； ④培养成本高。 2.昆虫表达系统 杆状病毒基因组：闭环双链DNA，88-166kb 表达系统 杆状病毒表达系统（BEVS） 家蚕核型多角体病毒-家蚕表达系统 宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅目、毛翅目的600多种昆虫 克隆基因方法：转移载体→共转染→同源重组→空斑筛选→纯化→重组病毒 杆状病毒载体的构建发展 3. 哺乳动物细胞表达表达系统 当前，哺乳动物细胞表达已成为生物药物生产的重要技术。 哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。 优越性： ①糖基化与人源蛋白一致； ②能表达天然结构的完整蛋白，活性很高； ③可进行分泌表达。 缺点： ①表达量低； ②培养成本很高，操作繁琐。 常用宿主细胞 细胞名称 来源 已投放产品 BHK-21 地鼠幼鼠肾 凝血Ⅷ因子 CHO-K1 中国仓鼠卵巢 tPA，Ⅷ因子，EPO，G-CSF等 C127 小鼠乳腺肿瘤 GH MDCK 长耳狗肾脏 兽用疫苗 Namalwa Burkitt淋巴瘤病人的类淋巴母细胞 EPO，LT，tPA，IFN Vero 成年非洲绿猴肾 HBsAg，GH 鼠骨髓瘤细胞 骨髓瘤 tPA，抗体 COS SV40转化的绿猴肾细胞 CD34，CD69，TGF 表达栽体 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。 哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件 根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。 病毒载体:是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。 常用的病毒载体有SV40病毒、腺病毒、反转录病毒、痘苗病毒 杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视，这是因为它与其它病毒载体相比有特有优势，如可通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒；可感染多种哺乳动物细胞，但在细胞内无复制能力，生物安全度高；可插入高达38 kb的外源基因等。 质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。 整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在，如SV40病毒载体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。利用 Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒载体感染哺乳动物细胞表达的蛋白在结构与功能上与天然哺乳动物来源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒载体感染哺乳动物细胞获得的外源蛋白占细胞总蛋白的； 附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点 的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的 问题，但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。 猴多瘤病毒DNA（SV40） SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNASV40可以与所有哺乳动物宿