HLA分型技术在骨髓库上海分库高分辨检测工作中的初步应用.docx

HLA分型技术在骨髓库上海分库高分辨检测工作中的初步应用 刘嫌 杨剑豪 郑皆炜 谢军华 孙瑛 杜可明（上海血液屮心HLA高分辨实验 室 20005 1 ） 【摘要】HLA分型技术在骨髓库上海分库高分辨检测工作中的初步应用。方法： 使用ABI3730XIDNA测序仪，采用SBT单链直接测序法，对上海地区的960份 自愿加入屮华骨髓库的志愿者血液标本进行DNA测序，其屮HLA?I类基因对第 2, 3和4外显子单链单向测序，II类基因对第2外显子单链单向测序，以得 HLA高分辨分型结果；对部分呈现血清学表达不一致的模棱两可高分辨结果标本, 通过SSO技术确认；对部分呈现血清学表达一致的模棱两可高分辨结果标本， 通过SSP或对2, 3, 4以外的外显子单链检测作进一步确认。结果：960份中 华骨髓库上海分库的样本进行HLA的PCR-S盯高分检测，用DNA单链测序法一 次性获得高分辨结果为720例；对部分呈现血清学表达一致的模棱两可高分辨 结果标本，通过SSP技术或2, 3, 4以外的外显子单链检测做进一步确认，共 计标本211例；对于部分呈现血清学表达不一致的21例模棱两可高分辨结果标 本我们采用SSO技术最终确认了唯一的高分结果；此外，还检测到待确认新基 因4例。完成了本次实验标本100%高分结果入库要求。结论：S盯单链测序技 术为主，PCR-SSO, PCR-SSP联合为辅，是骨髓库开展HLA高分辨分型工作的有 力工具。 【关键词】SBT单链测序技术PCR-SSO PCR-SSPHLA高分辨分型屮华骨髓库上 海分库 人类主要组织兼容性抗原分子对于T细胞免疫的专一性鉴别扮演极重 要的角色⑴，在器官或骨髓的移植过程中，捐赠者及受赠者的人类主要组织兼 容性抗原分子兼容程度对于移植结果有相当大的影响，因此双方的HLA分型鉴 定是移植Z前一个必要的步骤。每年，屮华骨髓库都对每位志愿加入屮国造血干 细胞捐献者资料库的志愿者做采样及HLA分型工作，为了提高库容使用率，增 大移植量，减少流失率，骨髓库对HLA分形结果的要求也愈来愈高。过去对H LA的检测主要采用血清学方式[2],但由于HLA基因具有相当高的多态性，大 多HLA抗原之间仅有极少数、甚至只有一个氨基酸的差异存在，因此以过去的 血清学方式已经无法像DNA检测方式一样有效的进行HLA分型,PCRSBI；SSO,SSP 等检测技术正逐渐取代成为HLA检测的主要手段。 1材料与方法 1.1标本来源上海地区的960份志愿者血液标本。 1.2血样采集和基因组DNA制备静脉抽取受检者全血（EDTA抗凝） 5ml,用DNA提取试剂盒（美国Texas BioGene公司）提取基因组DNA,供 PCR-SSO,PCR-SSP和DNA测序用，剩余血标本于?80°C冻存备用。 DNA单链序列分析用PCR?S盯高分辨测序分型试剂（美国Texas BioGene公司严格按试剂说明书操作，首先取基因组DNA加酶和Buffer进行 DNA扩增，再用1.5?2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行确认；最后消化酶 对扩增产物进行纯化，在ABI3730XIDNA测序仪上作序列检测。所获数据用 ACCUTYPE分型软件处理生成HLA分型报告。 PCR — SSP严格按试剂说明书操作，根据HLA核昔酸碱基序列的 多态性设计出特异性引物，和DNA序列互补结合，经PCR反应产生相应条带, 若组中存在与特异性引物互补结合的DN A序列，即样本为该SSP结合的HLA 基因阳性。 PCR — SSO技术（序列特异性寡核背酸聚合酶链反应）严格按试 剂说明书操作，利用多种等位基因特异碱基序列的互补寡核昔酸探针，与特定片 段PCR扩增产物进行杂交，用荧光免疫检测系统检测，在短吋间内鉴定DNA的 多态性。 2结果 2.1采用DNA提取试剂盒提取DNA, DNA样本必须溶解于灭菌水或溶 解液中，每份DN A的浓度调整至10?40 n g/l, A260/ A280比值介于1.65到1.8 之间。 2.2 960份中华骨髓库上海分库的样本进行高分检测，用DNA单链测序 法一次性获得高分辨结果为720例，约占总检测标本量的75%；针对部分呈现 血清学表达一致的模棱两可高分辨结果标本，我们又通过SSP技术或2, 3, 4以 外的外显子单链检测做进一步确认，共计标本211例，约占总检测标本量的22%； 针对部分呈现血清学表达不一致的21例模棱两可高分辨结果标本，我们用SSO 技术最终确认了唯一血清型，约占总检测标本量的2%；此外，还检测到待确认 新基因4例。至此，除新基因外，我实验室完成了本次实验标本100%高分结果 入库。 3讨论 HLA(HumanLeukocyteAntigen, HLA)是具有高度多态性的人类免疫遗传 基因，位于人类第六号染色体短