COX―2抑制剂对食管癌ECa―109细胞放射增敏作用.docxVIP

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COX-2抑制剂对食管癌ECa-109细胞放射 增敏作用 【摘要】目的探讨选择性环氧合酶-2 (C0X-2)抑 制剂NS-398作用于食管癌细胞株ECa-109,观察其放射增敏 作用,并对其可能增敏机制进行初步探讨。方法应用MTT 法检测NS-398对细胞的生长抑制率;克隆形成实验分析放 射增敏效应,流式细胞术(FCM)定量检测细胞凋亡;实时 荧光定量PCR检测凋亡相关基因Bcl-2及BaxmRNA表达。结 果NS-398可显著增强ECa-109细胞的放射敏感性,对细胞 的生长抑制作用呈时间与剂量依赖性;Ns-398显著增加放射 诱导的细胞凋亡,上调BaxmRNA表达,而Bcl-2表达无明显 变化(P0. 05)。结论NS-398可增强食管癌细胞ECa-109的 放射敏感性,其机制可能与上调Eax表达,上升Bax/Bcl-2 比例,激活线粒体凋亡通路,诱导细胞凋亡相关。 【关键词】环氧合酶-2抑制剂;辐射增敏;细胞凋亡; 食管癌细胞 食管癌是一种常见的消化道肿瘤,放射治疗为其主要治 疗手段之一,目前放疗效果尚不尽人意。放射增敏剂作为提 高放疗效果的一个重要途径,也已成为研究热点。新近发现 诱导型环氧合酶-2 (Cyclooxygenase-2, C0X-2)抑制剂在 体内外都有放射增敏作用[1-2],然其确切增敏机制尚未明 确。本研究探讨C0X-2抑制剂NS-398对食管癌细胞系 ECa-109的放射敏感性影响,并初步研究其可能增敏机制。 1资料与方法 1. 1 一般资料RPMI1640培养基、胰蛋白酶购自美国 GIBCO公司;胎牛血清为杭州四季青产品;MTT、DMSO、NS-398 均为Sigma产品;NS-398溶于DMSO中,现配现用。Trizol 为 Invit rogen 公司产品;Rever tAid firs t st rand cDNA Synthesis试剂盒为MBI产品;PCR试剂盒购自大连宝生物 公司;引物为上海伯亚公司合成;Annexin V-FITC Kit购自 Immunotech Company ( France )。Caspase-3Colorimetrie Assay Kit 系 BioVision (USA)产品;PMD18-T Vector 购自 TaKaRa Company。 Epics~XL II 型流式细胞仪 (Beckman-Coulter Company, USA);食管癌细胞株 ECa-109 为浙江大学医学院附属邵逸夫医院中心实验室保存。 1.2细胞培养 将ECa-109细胞接种于含双抗的10%胎牛 血清RPMI1640培养基中,37°C. 5%C02、饱和湿度培养箱中 培养。实验选取对数生长期细胞。 3 MTT实验检测药物毒性及适宜浓度将细胞以105/ 孔接种96孔板,24h后开始药物实验,NS-398设0、10、50、 100umol/L4个浓度组,每个浓度组各取12、24、48、72h 四个时间点检测,设不接种细胞的空白对照和只含1%°DMSO 的对照,每浓度每时间点重复4孔。采用MTT法在酶联免疫 检测仪上测定570nm处吸光度值(A),细胞存活率(%)二实 验孔A值/对照孔A值X 100%o 1.4克隆形成实验分析放射增敏效应实验分组:①单 照组;②联合组:照射+NS-398处理。根据不同照射剂量接 种适量细胞于培养皿,24h贴壁,联合组更换含25 umol/L 的NS-398培养液,两组继续培养24h,室温下分别接受0、 2、4、6、8、10Gy的6MVX-ray照射,照射后联合组更换无 药培养液,两组继续培养14天。甲醇固定,姬姆萨染色, 计数>50个细胞克隆数。经单纯用药校正后计算存活分数, 实验结果3次平均值。以多靶单击数学模型拟合细胞存活曲 线,计算参数DO、Dq及SER (放射增敏比)值。 1.5FCM检测细胞凋亡 实验分4组:①未处理组;②单 药组:含25 u mol/LNS-398培养液培养24h;③单照组:6MVX 线照射8Gy, SAD为100cm,机架角为180。,加1.5cm等效 组织填充物,剂量率lGy/min;④联合组:照射+药物。各组 取处理后细胞1X106个,按AnnexinV-FITCkit说明书步骤, 力口卩1染液511「Annexin V-FITC染液5uL,室温、避光培 育 30min,加入 900 M L Binding Buffer,上机检测,由 FS 和SS设门选定细胞,利用Coulter公司的System II TM软 件处理结果,每次实验均设阴性和阳性对照,并设3复孔。 1.6实时荧光定量PCR检测Bel-2、BaxmRNA表达PCR 引物用primer5. 0软件设计,并经GenBank校对,核实oBcl-2 引

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