抗CD3_CD28单抗对人T淋巴细胞共刺激作用的影响因素.docVIP

抗 CD3 、CD28 单抗对人 T 淋巴细胞共 抗 CD3 、CD28 单抗对人 T 淋巴细胞共刺激作用的影响因素 王顺友 孙雨 马宝骊 上海第二医科大学 上海市免疫学研究所 上海 200025 摘要 以抗 CD3 和抗 CD28 作为 T 细胞激活的第一和第二信号 , 观察二者不同浓度 , 不同作用顺序和不同作用时间对人 T 淋巴细胞增殖反应的影响 。结果显示单一的抗 CD3 和抗 CD28 不能刺激 T 细胞增殖 , 只有同时或在一定时间内接受二者的 共同刺激才能促使 T 细胞增殖 。单独接受抗 CD3 24h 或抗 CD28 16h 后 , T 细胞对相应的另一信号刺激呈低反应性 , 这一现 象可能与 T 细胞耐受及自身免疫病的发生有关 。 关键词 CD3 ; CD28 ; T 淋巴细胞 ; 增殖 ; 共刺激 Bretscher 和 Chon 于 70 年代初首次提出免疫识 别的双信号理论 。对 T 细胞而言 , 传导第一信号的 受体分子 是 T 细 胞 表 面 特 异 性 抗 原 受 体 ( TCR) , 结合 , 可 阻 断 T 细 胞 的 激 活 而 治 疗 移 植 排 斥 反 应7 。为此 , 我们观察了第一信号和共刺激信号对 T 细胞增殖的影响 。 它由 TCRαβ (或γδ) , CD3 复 合 物 (γδε) 和ζ 二 聚 1 材料和方法 体 (或ζη 异二聚体) 共同构成 。TCR 作 为 接 受 第 一信号的受体 , 其信息由 CD3 复合体分子向细胞内 传递 , 因此 , 抗 CD3 的单克隆抗体可以模拟第一信 号 , 刺激 T 细胞产生一系列的生化反应 ( 如蛋白质 的磷酸化) , Ca2 + 浓度升高 , 磷脂分解等1 。但是 , 免疫活性细胞在接受第一信号之后一定时间内如果 不能 接 受 第 二 信 号 的 刺 激 , 则 将 产 生 低 反 应 性 ( hypo2resposibility) 或灭能 ( anergy) 。因此 , 第一信 号决定了免疫反应的特异性 , 而第二信号决定了免 疫反应的量及其时空效应2 。到目前为止 , 对第二 信号 (共刺激信号) 的认识还不完整 。在已经发现 的第二 信 号 分 子 中 , CD80 ( B721 ) 是 最 重 要 的 一 类 。它表达于抗原提呈细胞 (APC) 表面 , 通过与 T 细胞表面受体 CD28 相互作用 , 激活接受第一信 号刺激的 T 细胞 , 使其增殖和分泌 IL223 。CD28 分 子接受 刺 激 后 , 也 能 传 递 一 种 不 依 赖 于 Ca2 + 的 , 并对免疫抑制剂环胞霉素 ( CsA) 和 FK506 有抗性 的信号4 。一般认为 , CD28 在传递 这 一 信 息 之 前 需要第一信号激活的 PTK 酶对其细胞浆内 DYMNM 区域的酪氨酸磷酸化 , 磷酸化的 CD28 能激活 PI23 激酶 , 后者进一步活化 PKCζ, 促进转录因 子 的 活 111 材料 CD28 单抗腹水 ( IgG1 , 3mg/ ml) 由 美 国 Bristol2Myers Squibb 药物研究所 Linsley 教授馈赠 ; CD3 单抗腹 水 ( 0175mg/ ml) 由 分 泌 CD3 单 抗 杂 交 瘤 (购自美国 ATCC 公司) 制备 。二种单抗经纯化 后用于下述实验 。 112 外周血 T 细胞分离 无菌抽取正常人外周血 , 肝素抗 凝 。用 淋 巴 细 胞 分 离 液 离 心 分 离 单 个 核 细 胞 , 经尼龙毛柱吸附后 , 得到非粘附细胞为纯化 T 细胞 , 经抗 CD3 、抗 CD28 、锥兰染色 , 计算纯度 、 CD28 阳性率及活力分别为 82 % 、79 %和 99 % 。培 养于含 10 %人 AB 型血清的 RPMI1640 培养液 。 113 抗 CD3 和抗 CD28 抗体的浓度对 T 细胞增殖的 影响 在 96 孔 板 内 , 每 孔 加 入 纯 化 的 T 细 胞 ( 2 × 106 / ml) 100μl ,不同稀释度的抗 CD3 或抗 CD28 抗体 100μl ,37 ℃,5 %CO2 条件下继续 培 养 96h , 在 实 验 结 束前 16h 加入 1815 ×103Bq 3H2TdR ,用多头细胞收集 仪收集细胞 ,液体闪烁计数仪测定放射性计数 。 114 共刺激时相 96 孔板内每孔加入纯化 T 细胞 2 ×105 / 孔 , 抗 CD3 单 抗