免疫组化方法(冰冻切片).doc

免疫组化方法（冰冻切片） A. 所需溶液和试剂 1. 二甲苯 2. 无水乙醇（ 100% 和 95% ，变性无水乙醇，组织学级） 3. 苏木精（可选） 4. 固定剂： 请参考产品说明书选取合适的固定剂。 a. 10% 中性福尔马林 b. 丙酮 c. 甲醇 d. 3% 甲醛溶液： 配制时，将 18.75 ml 16% 甲醛溶液加入到 81.25 ml 1X PBS 中。 5. 10X Tris 缓冲盐水 （10X TBS ）：在 800 ml 蒸馏水中加入 24.2 g 三羟甲基氨基甲烷 （Trizma base ，C4H 11NO 3）和 80 g 氯化钠（ NaCl ）。用浓盐酸将 pH 调节到 7.6 。 6. 漂洗（缓冲）液： 1 X Tris 缓冲盐水（ TBS ）。100 ml 10 X TBS 加 900 ml 水至 1L 。 7. 甲醇/ 过氧化氢： 配制时，将 10 ml 30% H 20 2 加入到 90 ml 甲醇中。保存在 -20° C。 8. 封闭液： 1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5% 正常山羊血清。 9. 配制时，将 500 μl 山羊血清和 30 μl Triton-X 100 加入到 9.5 ml 1X TBS 中。 10. 检测系统：根据厂家说明书使用。 已有的检测系统 * 。 11. DAB 试剂或合适的底物： 按产品说明配制。 B. 切片 1. 对于保存在 -80 ° C 的样品： 切片前先从冰箱中取出放在 -20 ° C 平衡 15 分钟左右。 这可以避免切 片时样品断裂。 2. 将样品切成大约 6-8 μm 厚，铺在带正电性的玻片上。 3. 固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片） C. 固定 注意： 参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂 1. 玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。 a. 10% 中性福尔马林： 室温 10 分钟。立即进行染色操作。 b. 冰丙酮： -20 ° C 10 分钟。风干。立即进行染色操作。 c. 甲醇 ：-20 ° C 10 分钟。立即进行染色操作。 d. 3% 甲醛溶液： 室温 15 分钟。立即进行染色操作。 e. 3% 甲醛/ 甲醇： 先在室温下 3% 甲醛中固定 15 分钟， 然后在 -20 °C 的 甲醇中固定 5 分钟（ 中间不漂洗 ）。立即进行染色操作。 D. 染色 1. 切片用漂洗液洗两次，每次 5 分钟。 2. 室温下，浸泡在 3% H 2 02 / 甲醇中孵育 10 分钟 3. 用漂洗液洗两次，每次 5 分钟。 4. 在切片上滴加封闭液，室温封闭 1 小时。 5. 按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。 6. 去掉切片上的封闭液，每个切片上加 100-400 μl 稀释的一抗。 4°C 孵育过夜。 7. 去掉抗体。用漂洗液洗 3 次，每次 5 分钟。 8. 根据厂家说明书，用合适的检测系统 * 检测。 9. 用漂洗液洗 3 次，每次 5 分钟。 10. 加入 100 –400 μl DAB 或合适的底物，近距离检测染色进展。 11. 一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。 12. 如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。 13. 切片用蒸馏水洗两次，每次 5 分钟。 14. 切片脱水： a. 在 95% 乙醇中孵育两次，每次 10 秒。 b. 在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 秒。 c. 在二甲苯中孵育两次，每次 10 秒。 15. 加上盖玻片。