焦磷酸测序技术检测猪甲型流感病毒方法.pptVIP

内 容 焦磷酸测序技术在动物检疫中应用的意义 焦磷酸测序的原理 焦磷酸测序检测猪A型H1N1流感的操作过程 焦磷酸测序用于猪流感检测的意义 猪A型流感：猪可能作为禽、猪、人流感病毒传播中唯一的共同易感宿主，其呼吸道上皮细胞同时具有人、禽流感病毒的受体，所以猪流感病毒具有感染人的潜力并作为流感病毒的“混合器”,在禽—猪—人的种间传播中起到非常重要的作用。 焦磷酸测序用于猪流感检测的意义 焦磷酸测序用于猪流感检测的意义 流感病毒在检测中存在的问题 传统的检测方法如病毒分离鉴定虽具特异性，但是检测周期特别长，常常需要两周或两周以上的时间，无法满足出入境检验检疫的需要； 国务院《生物安全管理条例》已经实施，按条例规定病原分离鉴定只能在相应级别的生物安全实验室内进行，但目前检验检疫系统内还没有经过认可的P3实验室用于动物检疫，也就是说使用病毒分离鉴定确证阳性结果属非法。 焦磷酸测序用于猪流感检测的意义 《国务院病原微生物实验室生物安全管理条例》第三章第二十三条规定 出入境检验检疫机构在实验室开展检测、诊断工作时，发现高致病性病原微生物或者疑似高致病性病原微生物，需要进一步从事这类高致病性病原微生物相关实验活动的，应当依照规定经批准同意，并在取得相应资格证书的实验室中进行。 为贯彻条例的规定，开展检测工作和亚型鉴定，需杜绝直接从事病原的研究。从分子水平上进行工作的开展，符合生物安全条例的精神。 焦磷酸测序用于猪流感检测的意义 RT－PCR、荧光RT－PCR此类方法虽特异灵敏，但可能存在假阳性反应。 解决办法，目前对可疑结果一般采用RT－PCR产物序列测定进行确证。 焦磷酸测序用于猪流感检测的意义 瓶颈：DNA序列测定做分子克隆，需要样品量大周期长，口岸采样一般采集咽喉试子，经实验前处理后，所剩样品较少，且病原含量较低，PCR产物量根本达不到传统测序所需要的量，无法进行测序工作。 本课题的主要技术手段——焦磷酸测序 Pyrosequencing焦磷酸测序技术的特点 试验设计理念 实验步骤 采样及样品的处理 鼻腔拭子 肌肉或组织脏器 应尽可能多保留一些样品，因为流感的特殊性，可能需要重复实验。 RNA提取 采用常规方法 试剂只要适合于RNA提取即可 试验进程（PCR）及电泳 直接进行H1、N1基因的PCR扩增 采用两步法 电泳检测PCR扩增结果 根据提供的扩增片段长度确定是否扩增到目标片段 如有杂带，可以增加纯化步骤 试验进程及结果 实验流程：分离纯化单链 Instrument design 测序反应 测序反应在28 ℃ 下于焦磷酸测序仪上检测，加样使用600 mbar/8 msec的加样压力和时间，每轮反应时间65秒。引物链随着不同dNTP的加入而延伸。随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。 标准的结构 结果判定 猪甲型H1N1流感病毒的确定： H1和N1 RT-PCR反应均为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段与H1、N1目标片段完全相同的，确定为猪甲型H1N1流感病毒亚型。 H1和N1 RT-PCR反应均为阳性的，H1和N1测序片段与目标片段有一个以上碱基不同定为可疑，进行HA或NA基因全序列测定，确定其亚型。 　H1、N1 RT-PCR反应全部或有一个为阴性的判定为非猪甲型H1N1流感病毒。 标准的结构 结果判定 甲型H1N1流感病毒的确定 中确定为猪甲型H1N1流感病毒的样品，建议采用本标准附录B.3中的引物，按本标准的方法及判定依据进行甲型H1N1流感病毒鉴定。 Thank you! * 猪A型H1N1流感病毒焦磷酸测序方法 报告人：徐彪 从2009年3月开始，陆续在墨西哥和美国发现人感染猪甲型H1N1流感［后改为A（H1N1）]疫情，目前已很多国家发现疑似病例 ，我国也确诊了两例 焦磷酸测序技术—— 分子诊断的黄金标准 特异性、灵敏性远远低于病毒 分离鉴定方法，可能存在假阳性反应。 实时荧光RT-PCR RT－PCR 测序确证遭遇瓶颈 Pyro + Sequencing = Pyrosequencing 焦磷酸技术 测序技术 焦磷酸测序 Pyrosequencing是将焦磷酸技术应用于DNA序列分析的新一代技术 分子水平上的研究最佳选择——获得分子诊断的黄金标准——基因序列——测序 焦磷酸测序用于猪流感检测的意义 PPi ATP APS＋ Luciferin＋ 硫酸化酶 双磷酸酶 荧光素酶 light time Pyrosequencing原理 DNA聚合酶 实时和定量序列分析结果 Sample sequence ：AGGCAG T T