马尔尼菲青霉camp依赖性蛋白激酶的功能初步研究-微生物学专业论文.docxVIP

复且大学硕士学位论文 复且大学硕士学位论文 马尔尼菲青霉cAMP依赖性蛋白激酶的功能初步研究 摘要 马尔尼菲青霉是青霉属中唯一的两相条件致病真菌，在25℃时呈菌丝态，无 致病性，37℃时呈酵母态，有致病性。它广泛分布于中国南部及东南亚地区，能 引起呼吸道、皮肤以及系统性霉菌病，特别是在免疫功能低下和艾滋病病毒感染 的患者中。尽管它具有非常重要的医学研究价值以及独特的温度调控的两相转换机 制，但对马尔尼菲青霉的研究由于基因组信息和有效操作方法的缺乏而受到局限。 在本研究中，我们从实验室早期建立的马尔尼菲青霉eDNA文库中，筛选 到了一个编码环腺苷酸依赖性蛋白激酶的c咖k基因。为了研究这个基因的功能， 我们构建了相应的RNA干扰表达盒，利用gus’片段序列将cdpk基因313 bp的正 反序列片段隔开，并由受木糖诱导的xylP启动子来调控RNA干扰。整个RNA干 扰载体通过根癌农杆菌介导转化马尔尼菲青霉，以博莱霉素为抗性标记进行突变子 的筛选，成功获得稳定遗传的转化子。荧光定量PCR结果表明这些转化子cdpk基 因的mRNA表达水平大大降低，RNA干扰效果明显。对转化子的表型进行研究发 现，cdpk基因沉默后对菌体细胞的形态，孢子的萌发过程无明显影响，但是却减 弱了菌落的生长速度，降低了红色色素的产量，并使马尔尼菲青霉几乎丧失了产 孢功能，这暗示着cdpk基因在马尔尼菲青霉孢子的形成中发挥重要功能，这些 结果也可能为深入研究马尔尼菲青霉中的cAMP．PKA信号途径奠定了基础。 关键词：马尔尼菲青霉；环腺苷酸依赖性蛋白激酶：RNAi；产孢 中图分类号l Q93 AbstractPenicillium Abstract Penicillium marneffei iS the only known thermally dimorphic opportunistic human pathogen of its genus．It exhibits with filamentous multinucleate hyphal form at 250C and switching to uninucleate yeast cells with intracellular pathogenesis at 370C．It has emerged as one of the most common opportunistic pathogen causing respiratory,skin and systemic mycosis among immunocompromised and AIDS patients，endemic in Southern China and South-east Asia．Despite its medical importance and its unusual thermal dimorphic character,a large part of户marneffei still remains unknown and relative molecular researches have been limited due to the lack of genomic information and effective genetic tools． In order to study the function of cdpk gene encodes a cAMP dependent protein kinase，which screened from our cDNA library ofP．marneffei,we designed an RNAi expression cassette．This cassette contained 3 1 3bp reverse and forward coding sequence ofthe cdpk gene separated by a segment ofgus’gene，and under the control of xy／P promoter induced by xylose to regulate the RNAi．Combined with Agrobacterium tumefaciesns-mediated transformation，this RNAi expression cassette was successfully introduced into P marneffei and bleomycin resistant gene Was used as selecting marker to select the mutants．The