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实验三、小鼠骨髓细胞微核试验 微核的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。 微核(Micronucleus)的概念 微核试验(Micronucleus test，MNT)的概念 微核试验是观察受试物能否产生微核的试验。主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂(染色体损伤)。 传统的微核试验是体内试验, 常用细胞小鼠骨髓多染红细胞(PCE) 微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常 核的分叶及核突出物相区别。由于红细胞在成熟之前最后一 次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中， 因此通常计数PCE细胞中的微核。 实验步骤 1．实验动物及处理 2．骨髓液的制备和涂片 3．固定 4．染色 5．观察计数 6. 结果分析与评价 1．试验动物及处理 （1）动物选择：小鼠，分为五组，每组8只 （2）染毒途径：腹腔注射 （3）受试物： 环磷酰胺 （4）剂量设计：12.5、25、50、75、100 mg/kg 染毒次数及取样时间：一般采用两次染毒或多次染毒。 两次染毒：第一次染毒后24小时进行第二次染毒， 6小时后取样； 多次染毒：每天染毒1次，连续染毒5天， 末次染毒后24小时取样。 2．骨髓液的制备和涂片 处死：颈椎脱臼法 处理： 取股骨，去掉血污和肌肉，用弯止血钳将骨髓 挤于预先滴有生理盐水的清洁载玻片上，混合均匀后推片 3．固定： 将推好晾干的骨髓片放进染色缸中，甲醇固定15分钟，取出晾干。 4．染色(建成试剂盒Giemsa染液) 用染液一3滴，染色8min，再加染液二6滴，洗耳球混匀5min。细流水冲掉玻片染色液，晾干。 5．观察计数 先用低倍镜观察，选择分布均匀的区域，再在油镜下观察计数。 PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）桔黄色。 细胞中的微核大半呈圆形，边缘光滑，嗜色性与核质一致，一个细胞内可以出现一个或多个微核。 计数1000个PCE中含微核的PCE数，并计算200个细胞中PCE/NCE的比值。 6. 结果分析与评价 本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。 PCE／NCE为评价细胞毒性的指标。 正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2）， 如果＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制； 如果＜0.05，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。 注意事项： 1. 注意不要把股骨剪断 2. 挤出骨髓处的肌肉要剔除干净 3. 滴到玻片上的生理盐水不要太多，涂时要涂匀， 以便推片 4. 染色前可以先看一下整体涂片情况，细胞分散度 是否良好 5. 关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优良的染色 MN（微核） NCE 正染红细胞 ( 成熟红细胞 ） 显微镜下微核观察
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