一、还原糖含量的测定.ppt

实 验 四 植物组织中还原糖的测定 —3,5-二硝基水杨酸比色法 一、实验目的： 1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理。 2、掌握比色法测定还原糖的操作方法。 二、实验原理: 1、还原糖：指含有游离的半缩醛(酮)基糖。 单糖都是还原糖；某些二糖是还原糖（如麦芽糖、乳糖等）；多糖为非还原糖。 2、总糖的提取及双、多糖的酸水解。 利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 2、还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应： 在碱性条件下，还原糖与DNS试剂反应，还原糖被氧化成糖酸及其它产物， DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。 3、在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质(3-氨基-5-硝基水杨酸)颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。 由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：苹果（约0.5 g） 2、仪器：水浴锅；可见分光光度计等。 3、试剂： （1）0.5 mg/mL葡萄糖标准液 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂(碱性) 四、实验步骤： 1、葡萄糖标准曲线的绘制: 取7支试管，按下表操作，以标准葡萄糖含量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 2、还原糖的提取 取0.5g样品于研钵中，加水2ml，充分研磨。 用2ml蒸馏水分三次冲洗研钵(总体积小于10 ml)，转入10ml离心管中。 在50℃水浴中恒温20分钟，冷却后于 4000r/min, 离心5分钟。 取上清转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，待测。 3、样品含糖量的测定: 取提取液0.5ml，按上表操作。 五、计算： 还原糖含量(μg/ g )= 测定还原糖其它方法 (1)蒽酮比色法： 强酸可使糖类脱水生成糠醛，糠醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，其颜色的深浅与糖含量成正比关系，在620nm波长下可测定其光密度值。 (2)砷钼酸比色法 还原糖在碱性条件下加热，可以定量地还原二价铜离子为一价铜离子，即产生砖红色地氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型地钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合物即砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖地含量（即被还原的Cu2O）成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后做标准，就可测得样品还原糖含量。 (3)费林试剂滴定法 费林试剂由甲乙两种溶液混合而成，甲液（硫酸铜）与乙液（氢氧化钠）生成天蓝色沉淀，在碱性溶液中，乙液（酒石酸钾钠）使氢氧化铜溶解生成一种络合物，还原糖在碱性加热条件下，可以定量还原费林试剂中Cu2+为Cu1+ ,使费林试剂脱色，其脱色的程度与还原糖含量成正比关系。 * 生物化学实验 学时：3 3-氨基-5-硝基水杨酸 (棕红色,A540) 3,5-二硝基水杨酸 (DNS) 1、葡萄糖标准曲线的绘制 2、还原糖的提取 3、样品含糖量的测定: 250 5min 冷却 0.5 0 0.5 5 光密度值 OD540nm 沸水 浴 χ1 0.5 200 0.1 0.4 4 150 0.2 0.3 3 100 0.3 0.2 2 50 0.4 0.1 1 0 0.5 0 0(参比溶液) 葡萄糖含 量（μg） DNS mL 蒸馏水 mL 葡萄糖 标准液 mL 管 号 还原糖提取液 蒸馏水 mL 4 混匀 还原糖含量χ1(μg) ×样液总体积 测定用样品液体积×样品鲜重(g) 六、思考题： 1、何谓还原糖？测定还原糖的方法还有哪几种? 2、本实验的注意事项?