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实验二 GSTZ基因的PCR扩增Amplifying GSTZ gene by Polymerase Chain Reaction 核酸的体外扩增 真核细胞内DNA的复制 聚合酶链反应（ Polymerase Chain Reaction，PCR） 一、PCR的基本原理： 一种模拟天然DNA复制的体外扩增法 PCR反应三部曲： 变性(denature)： 加热使双链DNA解开螺旋 ↓ 退火(annealing) 在退火温度条件下引物同模板杂交 ↓ 延伸(extend) 在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+ 和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物 PCR反应体系 PCR PARAMETER Pre-denature: 94℃ 5min PCR Cycles: Denature 94 ℃ 40sec Annealing 58 ℃ 35sec Extend 72 ℃ 1min30sec Totally 35~40 cycles Post-extend: 72 ℃ 7min PCR反应体系 PCR反应体系 引物-人工合成的寡核苷酸 一般PCR反应中引物的终浓度为0.1-1?mol/L，在此范围内产物量基本相同。引物浓度低于0.1?mol/L时，产物量降低；引物浓度过高会引导非特异产物扩增，还会增加引物二聚体的形成。 引物设计原则：软件+经验 引物长度以15-30个碱基为宜； 引物碱基尽可能随机分布，G+C含量宜在45~55%左右； 引物内部、引物之间不应形成二级结构； 避免重复多聚碱基； 引物与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性； 两个引物的Tm值要尽可能接近； 重组时引物设计的其它几个问题： PCR反应体系 三磷酸脱氧核苷（dNTPs） 四种三磷酸脱氧核苷（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，工作浓度应为20~200?mmol/L。所用的四种dNTP的浓度应相等，以使错误掺入率降至最低。dNTPs浓度过低则反应速度下降， dNTPs浓度过高则扩增特异性降低，而且当dNTP浓度高于50mM时也会抑制Taq DNA聚合酶的活性。 PCR反应体系 耐热DNA聚合酶 Taq聚合酶是从耐热菌（thermus aquatious）中提取出来的耐热酶，95℃仍有活性。该酶的应用浓度一般为1~2.5U/50?L反应体系，然而，酶的用量可依据不同的模板分子或引物而变化。酶浓度过高时，会出现非特异性扩增；过低时扩增产物量很低。 PCR反应体系 Mg2+ Mg2+ 是Taq DNA聚合酶活性所必需的。Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性、产物的特异性以及引物二聚体的形成等等。 循环参数 变性温度和时间 复性温度和时间 延伸温度和时间 循环数 变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃1min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 退火 (复性)温度与时间 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： 　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 　　复性温度=Tm值-(2～10℃) 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。 复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 延伸温度与时间 Taq DNA聚合酶的生物学活性： 　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子 　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 PCR PARAMETER Pre-denature: 94℃ 3min PCR Cycles: Denature 94 ℃ 30sec～1min Annealing Tm-(2～10℃) 30sec～1min Extension 72 ℃ based on the length of