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四 抗体的选择及保存和反应条件 （1）抗体的种属来源（宿主） 样本，一抗，二抗来自于不同种属 样本：大鼠 样本：人 一抗：兔 一抗：小鼠 二抗：山羊 二抗：兔 （2）反应特异性 该抗体适合检测哪些种属动物体内的抗 原，不同种属间可能存在反应差异。 （3）类型 单克隆抗体(小鼠来源),多克隆抗体。 （4）应用范围 IHC,WB,FC,ELISA,IP； 石蜡切片(IHC－P),冰冻切片(IHC－Fr), 甲醛固定冰冻切片（IHC-FoFr）。 (5)与抗原结合的部位 亚型， C-或N-，胞外区域或胞内区域。 （6）公司，价格。 用途 公司 用途 公司 最全 Santa cruz, abcam 细胞分选 美天旎 离子通道 alomone 激素 DAKO 信号转导 CST， Swant 新功能蛋白 Abnova 细胞因子 RD，RayBiotech 神经科学 Immunostar, millpore 激酶 AnaSpec ELISA试剂盒 RD，RayBiotech 信号通路激动剂、抑制剂、化合物库 Tocris, alomone 凋亡和流式抗体 BD, eBioscienc，BioVision 国外主要抗体试剂公司 （7）抗体的保存与孵育条件 ①保存的条件 一抗：用前分装，－20℃； 使用后，4 ℃。 标记二抗: 用前放于4 ℃ ； 长期不用，－20℃； 解冻后，4 ℃。 避免反复冻融。 ②孵育的温度与时间 一抗：4℃过夜（＋ 室温 30min～1h） 37 ℃， 1-2h。 二抗:室温或37℃， 30min～1h 。 ③浓度 每次使用新抗体前应当对其工作浓度 进行稀释测试，使阳性染色强而无背 景染色。 抗体稀释度的棋盘稀释测定法 注：括号内为背景染色 五 封闭血清的选择 （1）原因：样本里高电荷成分非特异性吸收抗 体；样本里可能含Fc受体而与抗体恒定区 结合。 （2）来源： 与二抗同一来源的正常动物血清, 非一抗来源的动物(牛，马)的血清, 2%牛血清白蛋白（BSA）。 加一抗前，室温或37℃，10-30min。 处理完后直接加一抗，不洗涤。 六 内源性酶灭活的问题 （1）原因： 在以酶做标记物时，内源性酶和生物素易与底物竞争结合而引起非特异性染色。 （2）方法： a:去除一般性酶 3%H2O2 ,10min； 0.3%H2O2-甲醇 ，10～30min。 现用现配，避光,干燥处保存。 b:去除内源性生物素 0.01％卵白素，20min。 c:去除碱性磷酸酶 加入24mg/mL的左旋咪唑于底物液中， pH维持在7.6-8.2。 d:去除酸性磷酸酶 加入50mmol/L的酒石酸于底物液中。 七 对照染色设计 (1)阳性对照:用已证实含靶抗原的标本与待 检标本同时做同样染色处理。 (2)阴性对照：用证实不含靶抗原或缺少免 疫试剂的同步处理和标记染色的对照。 a.阴性组织对照 以确知不含靶抗原的组织（细胞）标 本片与待检标本片同时染色。 b.阴性试剂对照 空白对照：用不加一抗的缓冲液（如 PBS）替代一抗。 替代对照：以第一抗体同源动物未免疫的正常血清或与本实验无关的抗体代替一抗。 吸收试验：第一抗体被过量的经纯化的抗原中和吸收，使其结合点全部被外源性抗原封闭。 抑制试验：待检标本先与未标记的特异性抗体反应，再与标记的特异性抗体结合，使染色结果明显减弱或转阴。 （3）自身对照： 同一标本片上，靶抗原的阳性反应与其他无关结构/成分的阴性结果可形成鲜明对比。 国际文章要求：各种对照＋Western blot 序号 实验 片 阳性组织片 阴性组织片 空白对照片 替代对照片 吸收对照片 结果判断 1 － － － － － － 假阴性，方法不可靠或操作有误 2 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 假阳性，非特异染色，需寻找原因 3 ＋ ＋ ＋ － － － 有怀疑，阴性组织对照片选择不准确，含有靶抗原 4 ＋ － － － － － 有