荧光定量PCR-上海交通大学医学院.PPTVIP

荧光定量PCR 乙肝病毒的定量检测 一.实验原理 荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又称实时PCR，是目前较精确的进行定量检测PCR的方法。 荧光定量PCR是在普通PCR基础上，加入荧光检测系统，通过荧光信号对PCR过程中产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量。 荧光PCR反应体系中含有的荧光探针(TaqMan水解探针) 两端带有荧光基团，5′端带有荧光报告基团（R基团）， 3′端带有荧光淬灭基团（Q基团）。当探针完整时R基团 与Q基团分别位于探针的两端，Q基团抑制R基团不能发 射荧光。 PCR过程中，TaqDNA聚合酶沿着模板移动合成新链，当移 动到与模板互补的探针处时，TaqDNA聚合酶同时发挥 5′→3′外切核酸酶活性，将探针的脱氧核苷三磷酸逐个 水解，R基团与Q基团分离，此时R基团不再受Q基团的抑 制而发射荧光，仪器检测到荧光信号。R基团信号强弱的 程度与PCR反应产物的拷贝数成正比，仪器根据标准曲线 和反应产物量计算出初始模板的拷贝数。 二.实验器材 1.荧光定量PCR仪器 2.微量移液器 3.实时定量PCR反应管（0.2ml） 4.离心机 三.实验试剂 1.混合工作液 2.标准品 3.模板DNA 4.阴性对照 5.阳性对照 *混合工作液”: 包含引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、5’端标记FAM荧 光基团的TaqMan水解探针、含Mg2+的缓冲液 *标准品: 核酸拷贝数为104、105、106、107 四.实验操作 1.配置标准品反应体系 已知核酸拷贝数为104、 105、106、107的标准品各 2μl，加入混合工作液各28μl，混合离心后进行定量 检测。 2.配置检测模板反应体系 模板DNA2μl，混合工作液28μl，混合离心后进行 定量检测。 3.阴性对照 阴性对照品2μl，混合工作液28μl，混合离心后 进行定量检测。 4.阳性对照 阳性对照品2μl，混合工作液28μl，混合离心后 进行定量检测。 5.将装有上述反应体系的PCR反应管放置在荧光PCR仪 上，按照程序设定各PCR反应管的位置和名称，并 输入标准品管核酸拷贝数等。 6.开始PCR循环，循环圈数为 50℃ 2分钟 1个循环 94℃ 2分钟 94℃ 10 秒 重复40个循环 60℃ 30 秒 7.标准曲线的绘制 PCR反应结束后利用已知起始拷贝数的标准品可作 出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵 坐标代表Ct值。 8.结果分析: (1).计算检测模板核酸拷贝数 读取检测模板的Ct值，即可从标准曲线上计算出 该样品的起始拷贝数。 (2).判断检测模板是否属于阳性标本. 上海交通大学医学院 2009年3月 / 吴洁敏 上海交通大学医学院 2009年3月